Transzmissziós elektron kriomikroszkópia - Transmission electron cryomicroscopy

CryoTEM kép GroEL szuszpendált amorf jég at 50 000 × nagyítás
A Pichia pastorisból származó alkoholoxidáz szerkezete a CryoTEM segítségével

A transzmissziós elektron kriomikroszkópia ( CryoTEM ), közönségesen krio-EM néven ismert, a kriogén elektron mikroszkópia egyik formája , pontosabban egy transzmissziós elektron mikroszkópia (TEM), ahol a mintát kriogén hőmérsékleteken (általában folyékony-nitrogén hőmérsékleteken) vizsgálják . A Cryo-EM egyre népszerűbb a szerkezeti biológiában .

A transzmissziós elektron kriomikroszkópia hasznossága abból fakad, hogy lehetővé teszi olyan minták megfigyelését, amelyeket semmilyen módon nem festettek vagy rögzítettek, megmutatva őket natív környezetükben. Ez ellentétben áll a röntgen-kristályográfiával , amely megköveteli a minta kristályosítását, ami nehéz lehet, és nem fiziológiai környezetbe helyezi, ami alkalmanként funkcionálisan lényegtelen konformációs változásokhoz vezethet.

Az elektrondetektoros technológia , különösen a DDE (közvetlen elektrondetektorok), valamint az erősebb szoftveres képalkotó algoritmusok fejlődése lehetővé tette a makromolekuláris struktúrák atomi közeli felbontásban történő meghatározását. A képalkotó makromolekulák közé tartoznak a vírusok , riboszómák , mitokondriumok , ioncsatornák és enzimkomplexek . 2018-tól kezdődően a krio-EM olyan kisméretű struktúrákra alkalmazható, mint a hemoglobin (64 kDa ), és legfeljebb 1,8 Å felbontással . 2019-ben a krio-EM struktúrák a Fehérje Adatbankban letétbe helyezett struktúrák 2,5% -át képviselték , és ez a szám tovább növekszik. A krio-EM alkalmazása a krioelektron tomográfia (krio-ET), ahol a minta 3D rekonstrukciója megdöntött 2D képekből készül.

Fejlődés

A CryoTEM eredeti indoklása eszköz volt a biológiai minták sugárkárosodásának leküzdésére . Az elektronmikroszkópban a minta képének összegyűjtéséhez szükséges sugárzás mennyisége elég nagy ahhoz, hogy a kényes szerkezeteknél a minta károsodásának lehetséges forrása legyen. Ezenkívül az elektronmikroszkóp oszlopához szükséges nagy vákuum miatt a minta környezete meglehetősen zord.

A vákuum problémáját részben megoldották negatív foltok bevezetésével, de negatív foltok esetén is a biológiai minták szerkezeti összeomlásra hajlamosak a minta kiszáradásakor . A mintáknak a szublimációs hőmérséklet alatti jégbe történő beágyazása már korán felmerült lehetőség volt, de a víz fagyáskor hajlamosabb alacsonyabb sűrűségű kristályrácsrá rendeződni, és ez tönkreteheti bármi szerkezetét, ami benne van.

Az 1980-as évek elején több szilárdtestfizikát tanulmányozó csoport különböző eszközökkel, például nagynyomású fagyasztással vagy gyorsfagyasztással próbálta meg üvegtest jég előállítását . 1984-ben a Jacques Dubochet által vezetett csoport az Európai Molekuláris Biológiai Laboratóriumban egy üveges vízrétegbe ágyazott adenovírus képeit mutatta be. Ezt a cikket általában a Cryo-EM eredetének jelzésére tekintik, és a technikát úgy fejlesztették ki, hogy rutinossá váljon a világ számos laboratóriumában.

A képalkotáshoz használt elektronok energiája (80–300 kV) elég magas ahhoz, hogy a kovalens kötések megszakíthatók legyenek. Ha a képalkotó minták sugárkárosodásoknak vannak kitéve, korlátozni kell a kép megszerzéséhez használt elektron expozíciót. Ezeknek az alacsony expozíciónak megköveteli, hogy több ezer vagy akár millió azonos fagyott molekula képét válasszák ki, igazítsák és átlagolják nagy felbontású térképek előállításához speciális szoftver segítségével. A szerkezeti jellemzők jelentős javulását 2012-ben érték el közvetlen elektrondetektorok és jobb számítási algoritmusok bevezetésével.

2015-ben Bridget Carragher és munkatársai, a Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy alkalmazásával olyan technikákat alkalmaztak, amelyeket Clint Potter és az általa kifejlesztett 3 Å-nél finomabb felbontású első krio-EM szerkezet meghatározása érdekében emeltek ki a CryoTEM eszközként, amely összehasonlítható és potenciálisan kiválóbb eszköz a hagyományos röntgenkristálytani technikákhoz. Azóta nagyobb felbontásokat értek el, ideértve a β-galaktozidáz bakteriális enzim 2,2 Å szerkezetét 2015 - ben és a glutamát dehidrogenáz 1,8 Å szerkezetét 2016-ban. A Cryo-EM-t különböző vírusok, köztük a Zika vírus , és nagy komplexekre, például a spliceosomára alkalmazták . 2017-ben a kémiai Nobel-díjat Jacques Dubochet , Joachim Frank és Richard Henderson közösen ítélték oda "krio-elektron mikroszkópia fejlesztéséért az oldatban lévő biomolekulák nagy felbontású szerkezeti meghatározásához".

Biológiai példányok

Vékonyfilm

A biológiai anyagot elektronmikroszkópos rácsra terítik, és fagyasztva-hidratált állapotban gyors fagyasztással tartják fenn , általában folyékony etánban , folyékony nitrogén hőmérséklet közelében . Ha a mintákat folyékony nitrogén hőmérsékleten vagy hidegebb hőmérsékleten tartják, az elektronmikroszkóp oszlop nagyvákuumába vezethetők . A legtöbb biológiai minta rendkívül rádióérzékeny , ezért alacsony dózisú technikákkal kell képet készíteni (hasznos, hogy a transzmissziós elektron kriomikroszkópia alacsony hőmérséklete további védelmi tényezőt nyújt a sugárkárosodás ellen).

Következésképpen a képek rendkívül zajosak . Egyes biológiai rendszerek esetében a képek átlagolásával növelhető a jel / zaj arány és nagy felbontású információk nyerhetők a mintáról az egy részecske elemzés néven ismert technikával . Ez a megközelítés általában megköveteli, hogy az átlagolt dolgok azonosak legyenek, bár némi korlátozott konformációs heterogenitás tanulmányozható (pl. Riboszóma ). A fehérjekomplexek és vírusok CryoTEM képeiből származó háromdimenziós rekonstrukciókat nanométeres vagy atomközeli felbontásra oldották meg, lehetővé téve új betekintést e nagy egységek szerkezetébe és biológiájába.

A fehérje rendezett tömbjeinek, például a transzmembrán fehérjék 2-D kristályainak vagy a spirális fehérje tömbinek elemzése egyfajta átlagolást is lehetővé tesz, amely nagy felbontású információt nyújthat a mintáról. Ezt a technikát elektronkristályosnak nevezzük .

Üvegtest szakaszok

A vékonyréteg-módszer vékony mintákra korlátozódik (tipikusan <500 nm), mert az elektronok nem képesek keresztezni a vastagabb mintákat többszöri szóródási esemény nélkül. A vastagabb mintákat üvegesíteni lehet etánban történő fagyasztással ( kriofixálás ) (akár több tíz μm vastagságig), vagy gyakrabban nagynyomású fagyasztással (akár több száz μm-ig). Ezután gyémánt késsel vékony (40-200 nm vastag) szakaszokra vághatók krioultramicrotomban , -135 ° C-nál (devitrifikációs hőmérséklet) alacsonyabb hőmérsékleten. A metszeteket elektronmikroszkóp rácsra gyűjtjük, és ugyanúgy képzeljük el, mint a vékony filmben üvegesített mintát. Ezt a technikát üvegtest metszetek transzmissziós elektron kriomikroszkópiájának (CEMOVIS) vagy fagyasztott-hidratált szakaszok transzmissziós elektron kriomikroszkópiájának nevezik.

Anyagminták

Amellett, hogy lehetővé teszi az üvegesített biológiai minták képalkotását, a CryoTEM alkalmazható a vákuumban túlságosan illékony anyagminták leképezésére is, standard szobahőmérsékletű elektronmikroszkóppal. Például a folyadék-szilárd interfészek üvegesített szakaszai kivonhatók elemzés céljából a CryoTEM segítségével, és a kén, amely hajlamos szublimálódni az elektronmikroszkópok vákuumában, stabilizálható és leképezhető a CryoTEM-ben.

Technikák

Különféle technikák használhatók a CryoTEM-ben. A népszerű technikák a következők:

  1. Elektron-kristályográfia
    1. Kétdimenziós kristályok elemzése
    2. A spirális szálak vagy csövek elemzése
    3. Mikrokristályos elektrondiffrakció (MicroED)
  2. Egy részecske elemzés (SPA)
    1. Időben megoldott CryoTEM
  3. Elektron kriotomográfia (krioET)

Lásd még

Hivatkozások

További irodalom

Külső linkek

Könyvtári források a
kriomikroszkópiáról