Immunocitokémia - Immunocytochemistry
Az immunocitokémia ( ICC ) egy elterjedt laboratóriumi technika , amelyet anatómiailag vizualizálni lehet egy adott fehérje vagy antigén lokalizációját a sejtekben egy speciális primer antitest alkalmazásával, amely kötődik hozzá. Az elsődleges antitest lehetővé teszi a fehérje vizualizálását fluoreszcens mikroszkóp alatt, amikor egy szekunder antitest kötődik, amelynek konjugált fluorofórja van . Az ICC lehetővé teszi a kutatók számára annak értékelését, hogy egy adott mintában lévő sejtek expresszálják- e a kérdéses antigént. Azokban az esetekben, amikor immunpozitív jelet találnak, az ICC lehetővé teszi a kutatók számára annak meghatározását is, hogy mely sejtek alatti részek expresszálják az antigént.
Immuno cito kémia vs. immun hiszto kémia
Az immunocitokémia abban különbözik az immunhisztokémiától , hogy az előbbit olyan ép sejtek mintáin hajtják végre, amelyekből a környező extracelluláris mátrixuk legnagyobb részét, ha nem az összeset eltávolították. Ez magában foglalja az egyes sejtek, amelyeket izolált egy blokk szilárd szövet, növesztett sejtek egy tenyészet , a sejteket letétbe a szuszpenzióban , vagy a sejteket, melyek egy kenet . Ezzel szemben az immunhisztokémiai minták a biológiai szövet metszetei , ahol minden sejtet szöveti felépítés és más sejtek vesznek körül, amelyek általában az ép szövetben találhatók. Az immunocitokémia olyan technika, amelyet egy specifikus fehérje vagy antigén jelenlétének felmérésére használnak a sejtekben (tenyésztett sejtek, sejtszuszpenziók) egy specifikus antitest alkalmazásával, amely kötődik hozzá, ezáltal lehetővé téve a vizualizációt és a mikroszkóp alatt történő vizsgálatot. Értékes eszköz az egyes sejtek sejttartalmának meghatározására. Az elemezhető minták közé tartoznak a vérkenet, az aspirátumok, a tamponok, a tenyésztett sejtek és a sejt szuszpenziók.
Számos módja van a sejtminták immunocitokémiai elemzésre történő előkészítésének. Mindegyik módszernek megvannak a maga erősségei és egyedi jellemzői, így a kívánt mintához és eredményhez megfelelő módszer választható.
A festendő sejtek szilárd hordozóra erősíthetők, hogy a későbbi eljárások során könnyen kezelhetők legyenek. Ez számos módszerrel érhető el: a tapadó sejteket mikroszkóp tárgylemezeken, fedőlemezeken vagy optikailag megfelelő műanyag hordozón tenyészthetjük. A szuszpenziós sejteket üveglemezekre ( citospin ) centrifugálhatjuk , kémiai összekötők segítségével szilárd hordozóhoz köthetjük, vagy egyes esetekben szuszpenzióban kezelhetjük.
Az alacsony viszkozitású közegben lévő koncentrált sejtszuszpenziók jó jelölteket jelentenek a kenetkészítmények számára. A híg közegben meglévő híg sejt szuszpenziók a legalkalmasabbak a citospinek citocentrifugálás útján történő előállítására. A nagy viszkozitású közegben létező sejtszuszpenziók a legalkalmasabbak tamponkészítményként történő tesztelésre. Ezen készítmények között állandó az, hogy az egész sejt jelen van a tárgylemez felületén. Bármely sejtközi reakció lejátszódásához az immunglobulinnak először be kell haladnia a sejtmembránon, amely ép ezekben a készítményekben. A magban lejátszódó reakciók nehezebbek lehetnek, és az extracelluláris folyadékok egyedülálló akadályokat okozhatnak az immunocitokémia teljesítésében. Ebben a helyzetben szükségessé válik a sejtek permeabilizálása detergens (Triton X-100 vagy Tween-20) alkalmazásával vagy szerves fixálószerek (aceton, metanol vagy etanol) kiválasztásával.
Az antitestek fontos eszköz az antigén jelenlétének és szubcelluláris lokalizációjának bemutatására. A sejtfestés nagyon sokoldalú technika, és ha az antigén nagymértékben lokalizált, akkor akár ezer antigénmolekula is kimutatható egy sejtben. Bizonyos körülmények között sejtfestést is alkalmazhatunk az antigén hozzávetőleges koncentrációjának meghatározásához, különösen képelemző eszközzel.
Mód
Számos módszer létezik immunológiai kimutatásra a szöveteken, beleértve azokat is, amelyek közvetlenül a primer antitestekhez vagy antiszérumokhoz vannak kötve. A közvetlen módszer magában foglalja egy detektálható tag (pl. Fluoreszcens molekula, aranyrészecskék stb.) Alkalmazását közvetlenül az antitesthez, amelynek azután hagyják kötődni az antigénhez (pl. Fehérjéhez) egy sejtben.
Alternatív megoldásként sok közvetett módszer létezik . Az egyik ilyen eljárásban az antigént egy primer antitest köti meg, amelyet az elsődleges antitesthez kötődő szekunder antitest alkalmazásával amplifikálnak . Ezután egy enzimatikus részt tartalmazó tercier reagens kerül alkalmazásra, amely a szekunder antitesthez kötődik. A kvaterner reagens vagy szubsztrát felvitelénél a tercier reagens enzimatikus vége a szubsztrátumot pigment reakciótermékké alakítja, amely színt eredményez (sokféle szín lehetséges; barna, fekete, piros, stb.) az a hely, ahol az eredeti primer antitest felismerte a kívánt antigént.
Néhány alkalmazott szubsztrátum (más néven kromogén) az AEC (3-amino-9-etil-karbazol) vagy a DAB ( 3,3'-diaminobenzidin ). Ezen reagensek egyikének felhasználása a szükséges enzimnek (pl. Torma-peroxidáznak antitestreagenshez konjugálva) való expozíció után pozitív immunreakciós terméket eredményez. A specifikus érdeklődésre számot tartó antigének immunocytokémiai vizualizációja akkor alkalmazható, ha egy kevésbé specifikus foltot, például a H&E-t (Hematoxylin és Eosin) nem lehet felhasználni a diagnózis felállításához vagy a kezeléssel kapcsolatos további prediktív információk nyújtásához (például néhány rák esetében).
Alternatív megoldásként a szekunder antitest kovalensen összekapcsolható egy fluoroforral (a FITC és a rodamin a leggyakoribb), amelyet fluoreszcencia vagy konfokális mikroszkópban detektálnak. A fluoreszcencia helye a célmolekulától függően változik, külső a membránfehérjéknél és belső a citoplazmatikus fehérjéknél. Ily módon az immunfluoreszcencia hatékony módszer konfokális mikroszkóppal kombinálva a fehérjék helyének és dinamikus folyamatainak ( exocitózis , endocitózis stb.) Tanulmányozására .