Indukált őssejtek - Induced stem cells

Az indukált őssejtek ( iSC ) olyan őssejtek, amelyek szomatikus , reproduktív , pluripotens vagy más sejttípusokból származnak szándékos epigenetikus átprogramozás útján. Ezek lehetnek egyrészt totipotens (ITC), pluripotens (iPSC) vagy progenitor (multipotens - IMSC, más néven egy indukált multipotens progenitor sejt - IMPC) vagy unipotent - (iUSC) aszerint, hogy azok fejlődési potenciálját és mértéke dedifferenciáció . A progenitorokat úgynevezett közvetlen átprogramozással vagy irányított differenciálással nyerik, és indukált szomatikus őssejteknek is nevezik .

Három technika széles körben elismert:

• A szomatikus sejtekből vett magok átültetése egy oocitába (tojássejt), amely nem rendelkezik saját magjával (laboratóriumban eltávolítva)
• Fusion a szomatikus sejtek pluripotens őssejtek és
• Szomatikus sejtek őssejtekké történő átalakítása, az átprogramozó fehérjefaktorokat , rekombináns fehérjéket kódoló genetikai anyag felhasználásával ; microRNS, szintetikus, önreplikálódó policisztronikus RNS és alacsony molekulatömegű biológiailag aktív anyagok.

Természetes folyamatok

1895 -ben Thomas Morgan eltávolította a béka két blasztomere közül az egyiket, és megállapította, hogy a kétéltűek képesek egész embriókat képezni a fennmaradó részből. Ez azt jelentette, hogy a sejtek megváltoztathatják differenciálódási útjukat. 1924 -ben Spemann és Mangold bemutatta a sejt -sejt indukció kulcsfontosságú fontosságát az állatok fejlődése során. Az egyik differenciált sejttípus sejtjeinek reverzibilis átalakulását metapláziának nevezik . Ez az átmenet része lehet a normális érési folyamatnak, vagy okozhatja ösztönzés.

Az egyik példa az átalakulás írisz sejtek lencse sejtek az érési folyamatot, és az átalakulás a retinális pigment epithelium sejtek a neurális retina regenerálás során a felnőtt gőte szemében. Ez a folyamat lehetővé teszi a szervezet számára, hogy az új körülményekre alkalmatlan sejteket alkalmasabb új sejtekkel helyettesítse. A Drosophila képzeletbeli lemezekben a sejteknek korlátozott számú standard diszkrét differenciálási állapot közül kell választaniuk. Az a tény, hogy a transzdetermináció (a differenciálódási út megváltozása) gyakran egy sejtcsoportnál, nem pedig egyes sejteknél fordul elő, azt mutatja, hogy az indukció helyett az érés része.

A kutatók képesek voltak azonosítani azokat a minimális feltételeket és tényezőket, amelyek elegendőek lennének a molekuláris és sejtes folyamatok kaszkádjának elindításához, hogy utasítsák a pluripotens sejteket az embrió megszervezésére . Ezek azt mutatták, hogy egymással szemben gradiensek a csont morfogenetikus fehérje (BMP) és Csomóponti , két transzformáló növekedési faktor család tagjai, hogy úgy járnak, mint morfogének , elegendő ahhoz, hogy előidézzük a molekuláris és celluláris mechanizmusok szükséges szervezni, in vivo vagy in vitro , nem kötött sejteket a zebrahal blasztula állati pólust jól fejlett embrióvá .

Az érett, speciális felnőtt sejtek bizonyos típusai természetesen visszatérhetnek az őssejtekhez. Például a "fő" sejtek kifejezik a Trója őssejtjelzőt. Bár általában emésztőfolyadékokat termelnek a gyomor számára, visszaállhatnak őssejtekbe, és átmenetileg javíthatják a gyomor sérüléseit, például a vágást vagy a fertőzés okozta károsodást. Ezenkívül észrevehető sérülések hiányában is képesek elvégezni ezt az átmenetet, és képesek teljes gyomoregységek feltöltésére, lényegében nyugalmi "tartalék" őssejtekként. A differenciált légúti hámsejtek in vivo stabil és működő őssejtekké válhatnak . A sérülés után az érett, terminálisan differenciálódott vesesejtek önmaguk ősibb változataiba differenciálódnak, majd a sérült szövetben cserére szoruló sejttípusokká differenciálódnak. A makrofágok megújulhatnak az érett differenciált sejtek helyi proliferációjával. A gólyáknál az izomszövet regenerálódik speciális izomsejtekből, amelyek differenciálódnak, és elfelejtik a sejttípust. Ez a regenerációs képesség nem csökken az életkor előrehaladtával, és összefüggésben lehet azzal, hogy képesek új őssejteket készíteni izomsejtekből igény szerint.

Számos nem tumorigenikus őssejt képes több sejttípust létrehozni. Például a többsoros differenciáló, stressztűrő (Muse) sejtek stressztűrő felnőtt emberi őssejtek, amelyek képesek önmegújulni. Jellemző sejthalmazokat alkotnak a szuszpenziós tenyészetben, amelyek a pluripotenciával kapcsolatos gének halmazát fejezik ki, és endodermális , ektodermális és mezodermális sejtekké differenciálódhatnak in vitro és in vivo.

A transzdifferenciálódás más jól dokumentált példáit és azok jelentőségét a fejlődésben és a regenerációban részletesen ismertették.

Az indukált totipotens sejteket általában szomatikus sejtek nukleáris transzferrel (SCNT) történő átprogramozásával lehet előállítani .

Az indukált totipotens sejtek

SCNT által közvetített

Az indukált totipotens sejteket szomatikus sejtek nukleáris transzferrel (SCNT) történő átprogramozásával nyerhetjük . A folyamat magában foglalja a szomatikus (test) sejt magjának kiszívását és befecskendezését egy petesejtbe, amelynek magját eltávolították

A Tachibana és mtsai által felvázolt protokollon alapuló megközelítés alkalmazásával az SCNT hESC-t tud előállítani bőrfibroblasztok magjainak felhasználásával mind egy középkorú 35 éves férfi, mind egy idős, 75 éves férfi esetében, ami arra utal, hogy az életkor -a kapcsolódó változások nem feltétlenül akadályozzák az emberi sejtek SCNT-alapú nukleáris átprogramozását. A szomatikus sejtek pluripotens állapotba való ilyen átprogramozása hatalmas lehetőségeket rejt magában a regeneratív gyógyászatban . Sajnos az ezzel a technológiával létrehozott sejtek potenciálisan nem teljesen védettek a beteg immunrendszerétől (a magok donorától), mivel ugyanazzal a mitokondriális DNS -sel rendelkeznek , mint a petesejtek donora, a betegek mitokondriális DNS -e helyett. Ez csökkenti azok értékét, mint autológ őssejt -transzplantációs terápia forrását ; Ami a jelenetet illeti, nem világos, hogy kiválthatja -e a beteg immunválaszát a kezelés során.

Indukált androgén haploid embrionális őssejtek használhatók a spermium helyett a klónozáshoz. Ezek az M fázisban szinkronizált és a petesejtbe fecskendezett sejtek életképes utódokat hozhatnak létre.

Ezek a fejlemények, valamint a mitotikusan aktív reproduktív őssejtekből származó korlátlan petesejtek lehetőségére vonatkozó adatokkal együtt lehetővé teszik a transzgenikus haszonállatok ipari termelésének lehetőségét. Az életképes egerek ismételt újraklónozása SCNT -módszerrel, amely hiszton -dezacetiláz -gátlót, trichostatint tartalmaz a sejttenyésztő táptalajhoz, azt mutatja, hogy lehetséges az állatok korlátlan újraklónozása anélkül, hogy láthatóan felhalmozódnának az átprogramozási vagy genomiális hibák. spermiumok és petesejtek kifejlesztése őssejtekből bioetikai kérdéseket vet fel .

Az ilyen technológiáknak messzemenő klinikai alkalmazásuk is lehet az emberi petesejtek citoplazmatikus hibáinak leküzdésére. A technológia például megakadályozhatja, hogy az öröklődő mitokondriális betegségek átadódjanak a jövő generációinak. A mitokondriális genetikai anyag anyától a gyermekig terjed. A mutációk cukorbetegséget, süketséget, szembetegségeket, gyomor -bélrendszeri rendellenességeket, szívbetegségeket, demenciát és más neurológiai betegségeket okozhatnak. Az egyik emberi tojás magja átkerült a másikba, beleértve a mitokondriumokat is, ami egy olyan sejtet hozott létre, amely két anyának tekinthető. A tojásokat megtermékenyítették, és a kapott embrionális őssejtek a felcserélt mitokondriális DNS -t hordozták. Bizonyítékként, hogy a technika biztonságos, e módszer szerzője rámutat az egészséges majmok létezésére, amelyek már több mint négy évesek - és különböző genetikai háttérrel rendelkező mitokondriális transzplantációk eredménye.

A késő generációs telomerázhiányos (Terc-/-) egerekben az SCNT által közvetített újraprogramozás nagyobb mértékben enyhíti a telomer diszfunkciót és a mitokondriális hibákat, mint az iPSC-alapú átprogramozás.

Más klónozási és totipotens transzformációs eredményeket is leírtak.

SCNT nélkül szerezték be

A közelmúltban néhány kutatónak sikerült totipotens sejteket szereznie az SCNT segítsége nélkül. A totipotens sejteket epigenetikus faktorok, például a hiszton oocita csíra izoformája alkalmazásával nyertük. Az in vivo újraprogramozás egerekben az Oct4, Sox2, Klf4 és c-Myc négy faktor átmeneti indukciójával totipotencia jellemzőket biztosít. Az ilyen in vivo iPS sejtek intraperitoneális injekciója embriószerű struktúrákat hoz létre, amelyek embrionális és extraembrionális ( trofektodermális ) markereket expresszálnak . Az egér pluripotens őssejtek fejlődési potenciálja mind az embrionális, mind az extra-embrionális törzsek létrehozásához is kibővíthető a mikroRNS miR-34a hiányával, ami az endogén MuERV-L (MERVL) retrovírusok erős indukciójához vezet .

Fiatalítás iPSC -khez

A pluripotens/embrionális őssejtek átültetése a felnőtt emlősök szervezetébe általában teratomák kialakulásához vezet , amelyek ezután rosszindulatú daganatos teratokarcinómává alakulhatnak. A teratokarcinóma sejteknek az embrióba történő behelyezése azonban a blasztociszta stádiumban okozta azok beépülését a sejtmasszába, és gyakran normális egészséges kiméra (azaz különböző szervezetek sejtjeiből álló) állatot eredményezett.

Az iPSc -t először transzplantálható teratokarcinóma formájában kapták, amelyet egér embriókból vett graftok indukáltak. Teratocarcinoma szomatikus sejtekből alakult ki. Genetikailag mozaik egereket kaptak rosszindulatú teratokarcinóma sejtekből, megerősítve a sejtek pluripotenciáját. Kiderült, hogy a teratokarcinóma sejtek képesek a pluripotens embrionális őssejtek tenyészetét differenciálatlan állapotban fenntartani, mivel a tenyésztő tápközeget különféle tényezőkkel látják el. Az 1980 -as években világossá vált, hogy a pluripotens/embrionális őssejtek átültetése a felnőtt emlősök szervezetébe általában teratomák kialakulásához vezet , amelyek aztán rosszindulatú daganat teratokarcinómává alakulhatnak. Azonban, amikor teraszkarcinóma sejteket helyeztek az embrióba a blasztocisztás stádiumban, ezek beépültek a belső sejtmasszába, és gyakran normális kiméra (azaz különböző szervezetek sejtjeiből álló) állatot eredményeztek. Ez azt jelezte, hogy a teratoma oka disszonancia - kölcsönös félreértés a fiatal donorsejtek és a környező felnőtt sejtek között (a befogadó úgynevezett " rése ").

2006 augusztusában a japán kutatók megkerülték a petesejt szükségességét, mint az SCNT esetében. Azáltal reprograming egér embrionális fibroblasztok be pluripotens őssejtek keresztül ektópiás expressziója négy transzkripciós faktorok , nevezetesen Oct4 , Sox2 , Klf4 és c-Myc , bizonyították, hogy a túlzott kifejeződése egy kis több tényező is nyomja a sejt átmenet egy új, stabil olyan állapot, amely több ezer gén aktivitásának változásával jár.

Az emberi szomatikus sejteket pluripotenssé teszik, ha azokat pluripotenciát indukáló tényezőkkel transzdukálják (OCT 3/4, SOX2, Klf4, c-Myc, NANOG és LIN28). Ennek eredményeként IPS sejtek termelődnek, amelyek a három embrionális csíraréteg (Mesoderm, Endoderm, Ectoderm) bármely sejtjévé differenciálódhatnak.

Az újraprogramozási mechanizmusok tehát összekapcsolódnak, nem pedig függetlenek, és kis számú génre koncentrálnak. Az IPSC tulajdonságai nagyon hasonlítanak az ESC -khez. Kimutatták, hogy az iPSC-k támogatják az összes iPSC egerek kifejlődését tetraploid (4n) embrió használatával, ami a legszigorúbb fejlődési potenciál vizsgálat. Egyes genetikailag normális iPSC-k azonban nem tudtak teljesen iPSC egereket előállítani a lenyomatos Dlk1-Dio3 génfürt rendellenes epigenetikus elnémítása miatt . Egy Hans Schöler vezette csapat (aki 1989-ben fedezte fel az Oct4 gént) kimutatta, hogy az Oct4 túlexpresszió a célon kívüli gén hatalmas aktiválását eredményezi az újraprogramozás során, ami rontja az iPSC-k minőségét. Az OSKM-hez (Oct4, Sox2, Klf4 és c-Myc) képest, amelyek rendellenes lenyomat- és differenciálódási mintákat mutatnak, az SKM (Sox2, Klf4 és c-Myc) újraprogramozása nagy fejlődési potenciállal rendelkező iPSC-ket hoz létre (közel 20-szor nagyobb, mint az OSKM) egyenértékű az embrionális őssejtekkel , amint azt az a képességük határozza meg, hogy képesek-e teljes iPSC egereket generálni a tetraploid embriókomplementáció révén.

Az iPSC fontos előnye az ESC -vel szemben, hogy felnőtt sejtekből származhatnak, nem pedig embriókból. Ezért lehetővé válik az iPSC beszerzése felnőtt, sőt idős páciensektől.

A szomatikus sejtek iPSC -kbe való átprogramozása megfiatalodáshoz vezet. Azt találták, hogy az újraprogramozás a telomerek meghosszabbodásához, majd a fibroblaszt-szerű származékká való differenciálódásuk utáni rövidüléshez vezet. Így az újraprogramozás az embrionális telomerhossz helyreállításához vezet, és ezáltal megnöveli a sejtosztódások potenciális számát, amelyeket egyébként korlátoz a Hayflick -határ .

A megfiatalított sejtek és a befogadó idősebb sejtjei körüli disszonancia miatt azonban saját iPSC injekciója általában immunválaszhoz vezet , amelyet orvosi célokra lehet használni, vagy daganatok, például teratoma kialakulásához. A feltételezett ok az, hogy egyes ESC -k és iPSC -k által in vivo differenciált sejtek továbbra is szintetizálják az embrionális fehérje -izoformákat . Tehát az immunrendszer felismerheti és megtámadhatja azokat a sejteket, amelyek nem működnek megfelelően.

A MitoBloCK-6 nevű kis molekula halálra kényszerítheti a pluripotens őssejteket, mivel apoptózist vált ki (a citokróm c felszabadulása révén a mitokondriális külső membránon keresztül) az emberi pluripotens őssejtekben, de nem a differenciált sejtekben. Röviddel a differenciálódás után a leánysejtek ellenálltak a halálnak. Amikor a MitoBloCK-6-ot bevezették a differenciált sejtvonalakba, a sejtek egészségesek maradtak. A túlélés kulcsa feltételezések szerint a pluripotens őssejt -mitokondriumok által a sejtek differenciálódásának folyamatában bekövetkezett változásoknak köszönhető. A MitoBloCK-6 ezen képessége, hogy elkülönítse a pluripotens és differenciált sejtvonalakat, potenciálisan csökkenti a teratomák és egyéb problémák kockázatát a regeneratív gyógyászatban.

2012 -ben más kis molekulákat (humán pluripotens őssejtek szelektív citotoxikus gátlói - hPSC -k) azonosítottak, amelyek megakadályozták, hogy az emberi pluripotens őssejtek teratómákat képezzenek egerekben. Ezek közül a legerősebb és legszelektívebb vegyület (PluriSIn #1) gátolja a sztearoil-coA-deszaturázt (az olajsav bioszintézisének kulcsfontosságú enzimét ), ami végül apoptózist eredményez. Ennek a molekulának a segítségével a differenciálatlan sejtek szelektíven eltávolíthatók a tenyészetből. Egy hatékony stratégia szelektív megszüntetése pluripotens sejtek teratomát potenciális célba pluripotens őssejt-specifikus anti-apoptotikus faktor (ok) (azaz survivin vagy Bcl10). Egyetlen kezelés kémiai survivin inhibitorokkal (pl, kvercetin vagy YM155) képes indukálni a szelektív és a teljes sejt halála differenciálatlan hPSCs és azt állította, hogy elegendő ahhoz, hogy megakadályozza a teratoma képződést a transzplantáció után. Nem valószínű azonban, hogy bármilyen előzetes engedélyezés képes lenne biztosítani az iPSC -k vagy ESC -k újratelepítését. A pluripotens sejtek szelektív eltávolítása után gyorsan újra megjelennek azáltal, hogy a differenciált sejteket őssejtekké alakítják vissza, ami tumorokhoz vezet. Ennek az lehet az oka, hogy zavarta a cél-let6 - szabályozás a Nr6a1 (más néven csírasejt-nukleáris faktor- GCNF), a pluripotencia gének embrionális transzkripciós represszorja, amely szabályozza a génexpressziót a felnőtt fibroblasztokban a mikro-RNS miRNS elvesztése után.

A pluripotens őssejtek teratóma-képződését a PTEN enzim alacsony aktivitása okozhatja , amelyről beszámoltak arról, hogy elősegíti a nagyon tumorogén, agresszív, teratoma-kezdeményező embrionális karcinóma sejtek kis populációjának (a teljes populáció 0,1–5% -a) túlélését. . Ezeknek a teratoma-iniciáló sejteknek a túlélése összefüggésben áll a Nanog sikertelen elnyomásával , valamint a megnövekedett glükóz- és koleszterin-anyagcserével. Ezek a teratoma-iniciáló sejtek szintén alacsonyabb p53/p21 arányt fejeztek ki a nem tumoros sejtekhez képest. A fenti biztonsági problémákkal összefüggésben az iPSC -k használata sejtterápiában még korlátozott. Mindazonáltal számos más célra is felhasználhatók, beleértve a betegségek modellezését, a gyógyszerek szűrését (szelektív kiválasztását) és a különböző gyógyszerek toxicitási vizsgálatát.

Kis molekulájú modulátorok az őssejt sorsában.

A szövet nőtt IPSC-k, melyeket a „kiméra” embriók korai szakaszában egér fejlesztés, gyakorlatilag nem okoz immunválaszt (miután az embriók nőttek a felnőtt egerek) és alkalmasak autológ transzplantáció Ugyanakkor, a teljes A felnőtt sejtek in vivo szövetekben történő átprogramozása a négy faktor Oct4, Sox2, Klf4 és c-Myc átmeneti indukciójával egerekben több szervből származó teratómákat eredményez. Ezenkívül a sejtek részleges átprogramozása a pluripotencia felé in vivo egerekben azt mutatja, hogy a hiányos átprogramozás epigenetikai változásokat (a Polycomb célpontok sikertelen elnyomását és a megváltozott DNS -metilációt ) von maga után a sejtekben, amelyek elősegítik a rák kialakulását. Később azonban számos kutatónak sikerült ciklikus részleges átprogramozást végezni in vivo a Yamanaka faktorok rövid időn keresztül történő expressziója nélkül, későbbi karcinogenezis nélkül, így részben megfiatalítva és meghosszabbítva a progeroid egerek élettartamát. Az in vitro módszerrel, amely kissé hosszabb átprogramozási időszakokat alkalmaz (a lényeges megfiatalítás érdekében), a sejtek átmenetileg elveszítik sejtidentitásukat, de "újra megszerzik eredeti szomatikus sorsukat, amikor visszavonják az átprogramozási tényezőket".

Sejtkultúrára példa kis molekula mint eszköz helyett fehérje. a sejttenyészetben szerezni hasnyálmirigy lineage a mezodermális őssejtek a retinsav jelátviteli aktiválni kell, míg a sonic hedgehog útvonal gátolja, amely lehet tenni azáltal, hogy a média -ellenes shh antitestek , Hedgehog kölcsönható fehérje vagy ciklopamin - az első kettő fehérje, az utolsó pedig kis molekula.

Kémiai ösztönzés

Kizárólag kis molekulák használatával Deng Hongkui és munkatársai bebizonyították, hogy az endogén "mestergének" elegendőek a sejtek sorsának átprogramozásához. Pluripotens állapotot indukáltak egerekben felnőtt sejtekben hét kis molekulájú vegyület segítségével. A módszer hatékonysága meglehetősen magas: képes volt a felnőtt szöveti sejtek 0,02% -át iPSC -kké alakítani, ami a génbeillesztési konverziós arányhoz hasonlítható. A szerzők megjegyzik, hogy a CiPSC -kből előállított egerek "100% -ban életképesek és látszólag egészségesek voltak akár 6 hónapig". Tehát ennek a kémiai átprogramozási stratégiának lehetősége van funkcionális kívánatos sejttípusok előállítására klinikai alkalmazásokhoz.

2015-ben robusztus kémiai újraprogramozási rendszert hoztak létre, amelynek hozama akár 1000-szer nagyobb, mint a korábban ismertetett protokollé. Tehát a kémiai újraprogramozás ígéretes megközelítéssé vált a sejtek sorsának manipulálására.

Megkülönböztetés az indukált teratomától

Az a tény, hogy az emberi iPSC -k nemcsak emberekben, hanem bizonyos állati szervezetekben, különösen egerekben vagy sertésekben is képesek teratómák kialakulására, lehetővé tette a kutatók számára, hogy kidolgozzanak egy módszert az iPSC -k in vivo differenciálására. E célból a célsejtekbe történő differenciálódást előidéző ​​szert tartalmazó iPSC -ket olyan géntechnológiával módosított sertésbe vagy egérbe fecskendezik , amely elnyomta az immunrendszer aktiválását az emberi sejteken. A kialakult teratomát kivágjuk, és felhasználjuk a szükséges differenciált humán sejtek izolálására a sejtek felszínén lévő szövetspecifikus markerek elleni monoklonális antitest segítségével. Ezt a módszert sikeresen alkalmazták funkcionális myeloid, eritroid és limfoid humán sejtek előállítására, amelyek transzplantációra alkalmasak (de csak egereknél). A humán iPSC teratoma eredetű hematopoietikus sejtekkel beoltott egerek funkcionális immunválaszra képes humán B- és T-sejteket termeltek. Ezek az eredmények reményt adnak arra, hogy a páciens testreszabott sejtjeinek in vivo generálása megvalósítható, olyan anyagokat szolgáltatva, amelyek hasznosak lehetnek transzplantáció, humán antitest -generálás és gyógyszer -szűrési alkalmazások esetében. A MitoBloCK-6 és/vagy a PluriSIn # 1 alkalmazásával a differenciált őssejtek tovább tisztíthatók a teratoma-képző pluripotens sejtekből. Az a tény, hogy a differenciálódás még a teratoma fülkében is megtörténik, reményt ad arra, hogy a kapott sejtek kellően stabilak az olyan ingerekhez, amelyek képesek visszaállítani a dedifferenciált (pluripotens) állapotba, és ezért biztonságosak. Egy hasonló in vivo differenciálódási rendszert, amely graftolható vérképző őssejteket eredményez egér- és humán iPSC-kből teratoma-hordozó állatokban, kombinálva a hematopoiesis megkönnyítésére szolgáló manőverrel, ismertették Suzuki és mtsai. Megjegyezték, hogy sem leukémiát, sem daganatokat nem figyeltek meg a recipiensekben az iPSC-ből származó vérképző őssejtek intravénás injekciója után a besugárzott recipiensekbe. Ezenkívül ez az injekció többsoros és hosszú távú helyreállítást eredményezett a hematolimopoietikus rendszerben soros transzferek során. Egy ilyen rendszer hasznos eszközt biztosít az iPSC -k gyakorlati alkalmazására hematológiai és immunológiai betegségek kezelésében.

Ennek a módszernek a továbbfejlesztése érdekében azoknak az állatoknak (például egereknek), amelyekben humán sejtgraftot tenyésztenek, módosított genommal kell rendelkezniük, hogy minden sejtje expresszálja és felszínén humán SIRPα legyen . Annak megakadályozása érdekében, hogy a betegnek a transzplantáció után az allogén szervet vagy szövetet kiutasítsuk, amelyet az állat pluripotens őssejtjeiből növesztettünk, ezeknek a sejteknek két molekulát kell expresszálniuk: a CTLA4-Ig-t , amely megzavarja a T-sejt kostimulációs útvonalait és a PD-L1-t , amely aktiválja a T -sejtek gátló útját.

Lásd még: US 20130058900  szabadalom.

Differenciált sejttípusok

Retina sejtek

A közeljövőben megkezdődnek azok a klinikai vizsgálatok, amelyek célja az iPSC-k biztonságos alkalmazásának bizonyítása az életkorral összefüggő makuladegenerációban szenvedő emberek sejtterápiájában, amely a retina károsodásával vakságot okozó betegség. Számos cikk ismerteti a retina sejtek iPSC -kből történő előállításának módszereit és azok sejtterápiára történő felhasználásának módját. Az iPSC-ből származó retina pigmentált hámtranszplantációról szóló jelentések a kísérleti állatok vizuális irányított viselkedését mutatták 6 hétig a transzplantáció után. A klinikai vizsgálatok azonban sikeresek voltak: tíz, retinitis pigmentosa -ban szenvedő beteg látását helyreállították, köztük egy olyan nőt is, akinek csak 17 százaléka látott.

Tüdő- és légúti hámsejtek

A krónikus tüdőbetegségek, mint például az idiopátiás tüdőfibrózis és a cisztás fibrózis, vagy a krónikus obstruktív tüdőbetegség és asztma , a morbiditás és a mortalitás vezető okai világszerte, jelentős emberi, társadalmi és pénzügyi terhekkel. Ezért sürgősen szükség van hatékony sejtterápiára és tüdőszövet -tervezésre . Számos protokollt fejlesztettek ki a légzőrendszer legtöbb sejttípusának előállítására , amelyek hasznosak lehetnek a betegspecifikus terápiás sejtek levezetésében.

Reproduktív sejtek

Az iPSC-k egyes sorai alkalmasak arra, hogy hím csírasejtekké és petesejtszerű sejtekké differenciálódjanak egy megfelelő résen (retinsavban és sertés tüszőfolyadék-differenciáló közegben történő tenyésztéssel vagy szeminális csőbeültetéssel). Ezenkívül az iPSC transzplantáció hozzájárul a terméketlen egerek heréjének helyreállításához, bemutatva az ivSC és az in vitro ivarsejtek származásának lehetőségét.

Indukált őssejtek

Közvetlen transzdifferenciálás

A rák és a daganatok kockázata szükségessé teszi a klinikai használatra alkalmas, biztonságosabb sejtvonalak módszereinek kifejlesztését. Egy alternatív megközelítés az úgynevezett "közvetlen átprogramozás"-a sejtek transzdifferenciálása anélkül, hogy áthaladna a pluripotens állapoton. Ennek alapját a megközelítés az volt, hogy az 5-azacitidin - egy DNS-demetilezési reagenssel - képződését okozhatja a miogén , chondrogenikus, és adipogeni klónok egy halhatatlan sejtvonal az egér embrionális fibroblasztok, és, hogy az aktiválási egyetlen gén, később nevezték MyoD1, elegendő az ilyen átprogramozáshoz. Összehasonlítva az iPSC -kkel, amelyek átprogramozása legalább két hetet igényel, az indukált őssejtek képződése néha néhány napon belül megtörténik, és az átprogramozás hatékonysága általában sokszorosa. Ez az újraprogramozás nem mindig igényel sejtosztódást. Az ilyen újraprogramozásból származó sejtek alkalmasabbak a sejtterápiára, mivel nem képeznek teratomákat. Például Chandrakanthan és munkatársai, valamint Pimanda leírják a szövetregeneráló multipotens őssejtek (iMS-sejtek) keletkezését úgy, hogy az érett csont- és zsírsejteket átmenetileg egy növekedési faktorral kezelik ( vérlemezke-eredetű növekedési faktor –AB (PDGF-AB)) és 5-azacitidin. Ezek a szerzők kijelentik, hogy "az elsődleges mezenchimális őssejtekkel ellentétben, amelyeket kevés objektív bizonyítékkal használnak a klinikai gyakorlatban a szövetek helyreállításának elősegítésére, az iMS-sejtek közvetlenül hozzájárulnak az in vivo szövetek regenerációjához, kontextustól függően, daganatok kialakulása nélkül", és így "jelentős" alkalmazási terület a szövetek regenerálásában ".

Egy transzkripciós faktor transzdifferenciálódása

Eredetileg csak a korai embrionális sejteket lehetett rávenni identitásuk megváltoztatására. Az érett sejtek ellenállnak identitásuk megváltoztatásának, miután elkötelezték magukat egy bizonyos fajta mellett. Azonban egyetlen transzkripciós faktor, az ELT-7 GATA faktor rövid kifejezése képes a garat teljesen differenciált, speciális, nem endodermális sejtjeinek identitását átalakítani teljesen differenciált bélsejtekké ép lárvákban és felnőtt Caenorhabditis elegans gombaférgekben , anélkül, hogy egy differenciált köztes.

Transzdifferenciálás CRISPR által közvetített aktivátorral

A sejtek sorsa hatékonyan manipulálható epigenómszerkesztéssel , különösen a specifikus endogén génexpresszió CRISPR által közvetített aktivátorral történő közvetlen aktiválásával . Ha a dCas9 -et (amelyet úgy módosítottak, hogy már nem vágja le a DNS -t , de mégis meghatározott szekvenciákhoz és azokhoz való kötődéshez lehet vezetni) transzkripciós aktivátorokkal kombinálják, pontosan manipulálhatja az endogén génexpressziót. Ezzel a módszerrel Wei és mtsai fokozzák az endogén Cdx2 és Gata6 gének expresszióját CRISPR által közvetített aktivátorok által, ezáltal az egér embrionális őssejteket közvetlenül két embrió vonallá, azaz tipikus trofoblaszt őssejtekké és extraembryonic endoderm sejtekké alakították át. Hasonló megközelítést alkalmaztak az endogén Brn2, Ascl1 és Myt1l gének aktiválásának indukálására, hogy az egér embrionális fibroblasztokat indukált idegsejtekké alakítsák át. Így az endogén mester transzkripciós faktorok transzkripciós aktiválása és epigenetikai átalakítása elegendő a sejttípusok közötti konverzióhoz. Az endogén gének gyors és tartós aktiválása natív kromatin kontextusukban ezzel a megközelítéssel megkönnyítheti az átprogramozást átmeneti módszerekkel, amelyek elkerülik a genomi integrációt, és új stratégiát biztosít a sejtek sorsának specifikációjának epigenetikus akadályainak leküzdésére.

A regenerációt modellező szakaszos folyamatmodellezés

Az újraprogramozás másik módja a kétéltű végtag -regeneráció során előforduló folyamatok szimulálása . Az urodele kétéltűeknél a végtagok regenerálódásának korai lépése a vázizomszálak dedifferenciálódása a végtagszövetbe burkolózó sejtté. Azonban, szekvenciális kis molekula kezelésére az izomrostok a fenilahisztin, mioszeverin, reversine (a aurora B kináz inhibitor), és más vegyi anyagok (BIO (glikogén szintáz-3-kináz-inhibitor), lizofoszfatidsav (pleiotróp aktivátor a G-fehérje-kapcsolt receptorok) , SB203580 ( p38 MAP kináz inhibitor) vagy SQ22536 (adenilil -cikláz inhibitor)) új izomsejt -típusok, valamint más sejttípusok kialakulását okozza, mint például a zsír-, csont- és idegrendszeri sejtek prekurzorai.

Antitest-alapú transzdifferenciálás

A kutatók felfedezték, hogy a G-CSF -mimicking antitest aktiválhatja gyarapodását serkentő receptor csontvelő sejtek olyan módon, amely indukálja csontvelő sejtekben, amelyek normálisan fejlődni fehérvérsejtek válni neurális progenitor sejtek. A technika lehetővé teszi a kutatók számára, hogy nagy antitestek könyvtáraiban keressenek, és gyorsan kiválasszák a kívánt biológiai hatásúakat.

Átprogramozás baktériumok által

Az emberi gyomor -bél traktusban a szimbiontok és kommenálisok hatalmas közössége gyarmatosul. A kutatók demonstrálják azt a jelenséget, hogy a szomatikus sejtek baktériumok által átprogramozódnak, és felnőtt humán bőr fibroblaszt sejtekből multipotenciális sejtek keletkeznek, tejsavbaktériumok beépítésével. Ezt a sejtes transzdifferenciálódást a riboszómák okozzák, és "a gazdasejtek által lenyelt és emésztett donorbaktériumokon keresztül is előfordulhat, amelyek riboszómális stresszt okozhatnak és stimulálják a sejtfejlődési plaszticitást. "

Feltételesen átprogramozott sejtek

Schlegel és Liu kimutatták, hogy a tápláló sejtek és egy Rho-kináz inhibitor (Y-27632) kombinációja számos szövetből származó normál és tumoros hámsejteket indukál, hogy korlátlanul szaporodjanak in vitro. Ez a folyamat anélkül megy végbe, hogy exogén vírusos vagy celluláris géneket kellene transzdukálni. Ezeket a sejteket "feltételesen átprogramozott sejteknek" (CRC) nevezték el. A CRC indukciója gyors, és a teljes sejtpopuláció átprogramozásának eredménye. A CRC -k nem fejeznek ki nagy mennyiségű, az iPSC -re vagy az embrionális őssejtekre (ESC) jellemző fehérjét (pl. Sox2, Oct4, Nanog vagy Klf4). Ez a CRC-k indukciója visszafordítható, és az Y-27632 és az adagolók eltávolítása lehetővé teszi a sejtek normális differenciálódását. CRC technológia generálhat 2 × 10 ⁶ sejtet 5-6 napon tű biopsziák és generálhat kultúrák hidegtartósított szövetet és kevesebb mint négy életképes sejtek. A CRC -k megtartják a normális kariotípust, és nem tumorigenikusak maradnak. Ez a technika hatékonyan létrehozza az emberi és rágcsáló daganatokból származó sejtkultúrákat is.

Az a képesség, hogy kis daganatsejteket gyorsan elő tud készíteni kis biopsziás mintákból és fagyasztott szövetekből, jelentős lehetőségeket kínál a sejtalapú diagnosztikára és terápiára (beleértve a kemo-érzékenységi vizsgálatot is), és nagymértékben növeli a biobanki értéket. A CRC technológia segítségével a kutatók hatékony terápiát tudtak azonosítani egy ritka típusú tüdődaganatban szenvedő beteg számára. Engleman csoportja egy farmakogenómiai platformot ír le, amely megkönnyíti a CRC rendszer segítségével a rezisztenciát leküzdő gyógyszerkombinációk gyors felfedezését. Ezenkívül a CRC módszer lehetővé teszi a hámsejtek genetikai manipulációját ex vivo, és azok későbbi in vivo értékelését ugyanabban a gazdaszervezetben. Míg az első vizsgálatok kimutatták, hogy a hámsejtek és a svájci 3T3 sejtek J2 együttes tenyésztése elengedhetetlen a CRC indukciójához, a transzwell-tenyésztő lemezekkel a CRC-k indukálásához nincs szükség fizikai kapcsolatra az etetők és a hámsejtek között, és ami még fontosabb, a feeder sejtek besugárzása szükséges ehhez az indukcióhoz. A transzwell -kísérletekkel összhangban a kondicionált tápközeg CRC -ket indukál és tart fenn, ami a celluláris telomeráz aktivitás egyidejű növekedésével jár. A kondicionált közeg aktivitása közvetlenül korrelál a sugárzás által kiváltott feeder sejt apoptózisával. Így a hámsejtek feltételes újraprogramozását az Y-27632 és az apoptotikus tápláló sejtek által felszabaduló oldható faktor (ok) kombinációja közvetíti.

Riegel és mtsai. bizonyítják, hogy a normál emlőmirigyekből vagy az egér emlődaganat vírusának (MMTV) által okozott emlődaganatokból izolált egér ME sejtek korlátlan ideig tenyészthetők feltételesen átprogramozott sejtekként (CRC). A sejtfelszíni progenitor-asszociált markereket gyorsan indukálják a normál egér ME-CRC-kben az ME-sejtekhez képest. Azonban bizonyos emlő -progenitor alpopulációk, például a CD49f+ ESA+ CD44+ expressziója jelentősen csökken a későbbi szakaszokban. Ennek ellenére a háromdimenziós extracelluláris mátrixban növesztett egér ME-CRC-k emlő acináris struktúrákat eredményeztek. Az MMTV-Neu transzgenikus egér emlődaganatokból izolált ME-CRC-k magas HER2/neu szintet, valamint tumorindító sejtmarkereket, például CD44+, CD49f+és ESA+(EpCam) expresszálnak. Ezek az expressziós minták a CRC későbbi szakaszaiban is fennmaradnak. A szingenikus vagy meztelen egerek emlőzsírpárnáiba ültetett MMTV-Neu tumorokból származó korai és késői passzív ME-CRC-kben vaszkuláris daganatok alakultak ki, amelyek áttétet mutattak a transzplantációt követő 6 héten belül. Fontos, hogy ezeknek a daganatoknak a kórszövettana megkülönböztethetetlen volt az MMTV-Neu egerekben kialakuló szülői tumorokétól. A CRC rendszer alkalmazása egér emlőhámsejtekre vonzó modellrendszert biztosít a normál és transzformált egérhám genetikájának és fenotípusának tanulmányozására meghatározott tenyésztési környezetben és in vivo transzplantációs vizsgálatokban.

A CRC más megközelítése a CD47 gátlása- egy membránfehérje , amely a trombospondin-1 receptor. A CD47 elvesztése lehetővé teszi az elsődleges egér endothelsejtek proliferációját, növeli az aszimmetrikus osztódást, és lehetővé teszi, hogy ezek a sejtek spontán átprogramozódjanak, és többpotenciális embrió testszerű klasztereket képezzenek . A CD47 leütése akutan növeli a c-Myc és más őssejt-transzkripciós faktorok mRNS- szintjét a sejtekben in vitro és in vivo. A trombospondin-1 kulcsfontosságú környezeti jel, amely gátolja az őssejtek önmegújulását CD47-en keresztül. Így a CD47 antagonisták lehetővé teszik a sejtek önmegújulását és átprogramozását a c-Myc és más őssejt transzkripciós faktorok negatív szabályozásának leküzdésével. A CD47 in vivo blokádja antiszensz morfolino segítségével növeli a halálos teljes test besugárzásnak kitett egerek túlélését a csontvelőből származó sejtek megnövekedett proliferációs kapacitása és a sugárérzékeny gasztrointesztinális szövetek sugárvédelme miatt.

Vonal-specifikus erősítők

A differenciált makrofágok önmagukban megújulhatnak a szövetekben, és hosszú távon bővülhetnek a tenyészetben. Bizonyos körülmények között a makrofágok osztódhatnak anélkül, hogy elveszítenék az immunsejtekre specializálódott tulajdonságaikat - ami általában nem lehetséges differenciált sejtekkel . A makrofágok ezt úgy érik el, hogy aktiválják az embrionális őssejtekhez hasonló génhálózatot . Az egysejtes elemzés feltárta, hogy in vivo a proliferáló makrofágok lenyomhatják a makrofág-specifikus fokozó repertoárt, amely az önmegújulást szabályozó génhálózathoz kapcsolódik. Ez akkor történt, amikor két transzkripciós faktor MafB és c- Maf koncentrációja természetesen alacsony volt, vagy rövid ideig gátolt. A genetikai manipulációk, amelyek kikapcsolták a MafB-t és a c-Maf-ot a makrofágokban, arra késztették a sejteket, hogy önmegújító programot indítsanak. A hasonló hálózat embrionális őssejtek önmegújulását is szabályozza, de különálló embrionális őssejt-specifikus erősítőkkel van kapcsolatban.

Ezért a MafB- és c-Maf-kettős hiányos egerekből izolált makrofágok korlátlanul osztódnak; az önmegújítás a c-Myc-től és a Klf4 -től függ .

Közvetett vonalkonverzió

A közvetett vonalkonverzió egy újraprogramozási módszer, amelyben a szomatikus sejtek részben átprogramozott sejtek (pre-iPSC) műanyag közbenső állapotán átmennek, amelyet az újraprogramozási tényezők rövid expozíciója indukál, majd ezt követően egy speciálisan kifejlesztett kémiai környezetben (mesterséges rés) történő differenciálás következik be.

Ez a módszer hatékonyabb és biztonságosabb is lehet, mivel úgy tűnik, hogy nem okoz tumorokat vagy más nemkívánatos genetikai változásokat, és sokkal nagyobb hozamot eredményez, mint más módszerek. Ezen cellák biztonsága azonban továbbra is kérdéses. Mivel az iPSC előtti vonal átalakítása az iPSC újraprogramozási feltételek alkalmazásától függ, a sejtek töredéke pluripotens tulajdonságokat szerezhet, ha nem állítják le a differenciálódás folyamatát in vitro vagy további in vivo de-differenciálódás miatt.

Külső membrán glikoprotein

A pluripotens őssejtek közös jellemzője a külső membránjuk fehérje glikozilációjának sajátossága . Ez megkülönbözteti őket a legtöbb nempluripotens sejttől, bár nem a fehérvérsejtektől . Az őssejt felszínén található glikánok gyorsan reagálnak a sejtállapot és a jelátvitel változásaira, ezért ideálisak a sejtpopulációk kisebb változásainak azonosítására. Sok őssejt-marker sejtfelszíni glikán epitópokon alapul, beleértve a széles körben használt SSEA-3 , SSEA-4, Tra 1-60 és Tra 1-81 markereket. Suila Heli és mtsai. feltételezzük, hogy az emberi őssejtekben az extracelluláris O-GlcNAc és az extracelluláris O-LacNAc kulcsfontosságú szerepet játszik a Notch jelátviteli út finomhangolásában- egy nagyon konzervált sejtjelző rendszerben, amely szabályozza a sejtek sorsának specifikációját, differenciálódását, bal-jobb aszimmetriáját, apoptózisát, somitogenezis és angiogenezis, és kulcsszerepet játszik az őssejtek proliferációjában (Perdigoto és Bardin és Jafar-Nejad et al.

A külső membránfehérje glikozilációjának változásai a sejtállapotok markerei, amelyek valamilyen módon kapcsolódnak a pluripotenciához és a differenciálódáshoz. A glikozilációs változás nyilvánvalóan nem csak a génexpresszió inicializálásának eredménye, hanem fontos génszabályozóként is működik, amely részt vesz a differenciálatlan állapot megszerzésében és fenntartásában.

Például az ACA glikoprotein aktiválása , amely a glikozil-foszfatidil-inozitolt kapcsolja össze az emberi perifériás vér őssejtjeinek felületén, a Wnt , Notch-1 , BMI1 és HOXB4 gének fokozott expresszióját indukálja a PI3K / Akt / mTor / PTEN jelző kaszkádon keresztül, és elősegíti a képződést a hematopoietikus őssejtek önmegújuló populációjának.

Továbbá az ACA-függő jelátviteli útvonal által indukált őssejtek differenciálódása ACA-indukált pluripotens őssejtekhez vezet, amelyek képesek in vitro mindhárom csíraréteg sejtjévé differenciálódni . A lektinek pluripotens emberi őssejtek kultúrájának fenntartására irányuló képességének vizsgálata az Erythrina crista-galli (ECA) lektin felfedezéséhez vezetett , amely egyszerű és rendkívül hatékony mátrixként szolgálhat az emberi pluripotens őssejtek tenyésztéséhez.

Újraprogramozás proteoglikánnal

A szomatikus sejtek pluripotens állapotokká alakításának alternatív stratégiája lehet a fibroblasztok folyamatos stimulálása egyetlen ECM proteoglikán , a fibromodulin segítségével . Az ilyen sejtek képesek a vázizom -regenerációra, és jelentősen alacsonyabb a tumor kialakulásának kockázata, mint az iPSC -k. Az ilyen sejtek csökkent tumorigenitása összefüggésben áll a CDKN2B felülszabályozásával a rekombináns humán fibromodulin újraprogramozási folyamat során

Újraprogramozás fizikai megközelítéssel

Az E-kadherin sejtadhéziós fehérje elengedhetetlen a robusztus pluripotens fenotípushoz . Az iPS sejtgenerálás újraprogramozása során az N-kadherin helyettesítheti az E-cadherin funkcióját. A kadherinek ezen funkciói nem kapcsolódnak közvetlenül az adhézióhoz, mivel a gömb morfológiája segít megőrizni az őssejtek "ősszerűségét". Ezenkívül a gömbképződés a sejtek alacsony kötődési felületen történő kényszerű növekedése miatt néha újraprogramozást indukál. Például a neurális progenitor sejtek előállíthatók fibroblasztokból közvetlenül fizikai megközelítéssel, anélkül, hogy exogén átprogramozási tényezőket vezetnénk be.

A sejthez tapadó szubsztrátumok felületén lévő párhuzamos mikrobarázdák formájában megjelenő fizikai jelek helyettesíthetik a kis molekulájú epigenetikai módosítók hatását, és jelentősen javíthatják az újraprogramozási hatékonyságot. A mechanizmus a sejtek epigenetikai állapotának mechanomodulációján alapul. Pontosabban, "a csökkent hiszton -dezacetiláz -aktivitás és a WD ismétlődő domén (WDR5) - a H3 -metiltranferáz alegysége - mikroregulált felületek általi expressziójának szabályozása fokozott hiszton -H3 -acetilációhoz és metilációhoz vezet". Az igazított szál orientációjú nanoszálas állványok hasonló hatásokat fejtenek ki, mint a mikrobarázdák, ami arra utal, hogy a sejtek morfológiájának változásai felelősek lehetnek az epigenetikai állapot modulálásáért.

A sejtadhéziók szerepe az idegfejlődésben . A kép JWSchmidt Wikipédia -felhasználó jóvoltából, a GNU Free Documentation License alatt

Az aljzat merevsége fontos biofizikai jel, amely befolyásolja az idegi indukciót és az altípus specifikációt. Például a lágy szubsztrátok elősegítik a neuroepithelialis konverziót, miközben gátolják a hESC -k idegi gerinc differenciálódását BMP4 -függő módon. A mechanisztikus vizsgálatok több célzott mechanotransductive folyamat, amely mechanoszenzitív Smad foszforiláció és nucleocytoplasmic irányváltás, szabályozott merevségű függő Hippo / YAP tevékenységek és aktomiozin citoszkeleton integritását és összehúzódó .

Az egér embrionális őssejtek (mESC) önmegújításon mennek keresztül a citokin leukémia gátló faktor (LIF) jelenlétében . A LIF visszavonását követően a mESC -k differenciálódnak, amit a sejt -szubsztrát tapadás és a sejtterjedés fokozása kísér . A korlátozott sejtterjedés LIF távollétében azáltal, hogy vagy kémiailag meghatározott, gyengén tapadó bioszubsztrátokon tenyésztett mESC -ket, vagy a citoszkeletont manipulálta , lehetővé tette a sejtek differenciálatlan és pluripotens állapotban maradását. A korlátozott sejtterjedésnek a mESC önmegújulásra gyakorolt ​​hatását nem a megnövekedett sejtközi adhézió közvetíti, mivel a mESC adhézió gátlása az E-cadherin elleni antitest vagy siRNS blokkoló funkciót alkalmazva nem segíti elő a differenciálódást. Leírták az őssejtek sorsának lehetséges mechanizmusait, amelyeket az extracelluláris mátrixszal való fizikai kölcsönhatások okoznak.

Egy új módszert fejlesztettek ki, amely gyorsabban és hatékonyabban alakítja át a sejteket őssejtekké úgy, hogy „összenyomja” őket a 3D mikrokörnyezet merevségének és a környező gél sűrűségének felhasználásával. A technika nagyszámú sejtre alkalmazható, hogy ipari méretekben őssejteket állítsanak elő orvosi célokra.

Az újraprogramozási folyamatban részt vevő sejtek morfológiailag változnak a folyamat előrehaladtával. Ez fizikai különbségeket eredményez a tapadási erőkben a sejtek között. A pluripotens őssejtek, a részben átprogramozott sejtek, a differenciált utódok és a szomatikus sejtek közötti lényeges különbségek a „ragasztó aláírás” között lehetővé tették a szétválasztási folyamat kifejlesztését a pluripotens őssejtek mikrofluidikus eszközökben történő izolálására , amely:

1. gyors (az elválasztás kevesebb, mint 10 percet vesz igénybe);
2. hatékony (az elválasztás több mint 95 százalékos tisztaságú iPS sejtkultúrát eredményez);
3. ártalmatlan (a sejtek túlélési aránya meghaladja a 80 százalékot, és a kapott sejtek megőrzik a normális transzkripciós profilokat, differenciálódási potenciált és kariotípust).

Az őssejtek mechanikus memóriával rendelkeznek (emlékeznek a múltbeli fizikai jelekre) -a víziló jelátviteli útvonalának tényezőivel: Igen-asszociált fehérje (YAP) és transzkripciós koaktivátor PDZ-kötő doménnel (TAZ), amely intracelluláris mechanikus reosztátként működik-és amely a múltbeli információkat tárolja fizikai környezetet és befolyásolja a sejtek sorsát.

Idegi őssejtek

A stroke és sok neurodegeneratív rendellenesség, mint például a Parkinson -kór, az Alzheimer -kór és az amiotrófiás laterális szklerózis, sejtpótló terápiákat igényel. Az átalakított idegsejtek (cN -ek) sikeres alkalmazása transzplantációk során új utat nyit az ilyen betegségek kezelésére. Mindazonáltal a fibroblasztokból közvetlenül átalakított indukált neuronok (iN -ek) végső soron elkötelezettek, és nagyon korlátozott proliferációs képességük van, ami nem biztos, hogy elegendő autológ donor sejtet biztosít a transzplantációhoz. Az önmegújuló indukált idegi őssejtek (iNSC-k) további előnyöket nyújtanak az iN-ekkel szemben mind az alapkutatásban, mind a klinikai alkalmazásokban.

Például meghatározott növekedési körülmények között az egér fibroblasztokat egyetlen tényezővel, Sox2-vel lehet átprogramozni, hogy olyan iNSC-ket képezzenek, amelyek önállóan megújulnak a tenyészetben és a transzplantáció után, és képesek túlélni és integrálódni anélkül, hogy daganatokat képeznének az egér agyában. Az INSC-k felnőtt humán fibroblasztokból származtathatók nem vírusos technikákkal, így biztonságos módszert kínálva az autológ transzplantációhoz vagy a sejtalapú betegségmodellek kifejlesztéséhez.

Az idegi kémiailag indukált őssejtek (ciNPC -k) egér farokhegyi fibroblasztokból és humán húgyúti szomatikus sejtekből állíthatók elő exogén tényezők bevezetése nélkül, de - kémiai koktél, nevezetesen VCR (V, VPA , a HDAC -gátló; C, CHIR99021, egy inhibitor GSK-3-kinázok és R, RepSox , inhibitor TGF béta jelátviteli utak ), alatt fiziológiás hipoxiás állapotban . Alternatív koktélok, amelyek gátolják a hiszton-dezacetilezést, a glikogén-szintáz-kinázt és a TGF-β-utakat (ahol: nátrium-butirát (NaB) vagy Trichostatin A (TSA) helyettesíthetik a VPA-t, a lítium-klorid (LiCl) vagy a lítium-karbonát (Li2CO3) helyettesíthetik a CHIR99021-et, vagy A Repsox helyettesíthető SB-431542 vagy Tranilast termékekkel ) hasonló hatékonyságot mutatnak a ciNPC indukciójában. Zhang és munkatársai szintén beszámoltak az egér fibroblasztok nagy hatékonyságú átprogramozásáról indukált idegi őssejt-szerű sejtekbe (ciNSLC) kilenc összetevőből álló koktél segítségével.

A szomatikus sejtek indukált idegi őssejtekké történő közvetlen átalakításának számos módját írták le.

Az elvi kísérletek bizonyítása azt mutatja, hogy lehetséges az agyban átültetett emberi fibroblasztokat és emberi asztrocitákat átalakítani neuronokká, amelyeket úgy terveztek, hogy kifejezzék az idegi újraprogramozó gének indukálható formáit, amikor az átprogramozás után aktiválódnak a gének ( Ascl1 , Brn2a és Myt1l ). kábítószer használatával.

Az asztrociták - a leggyakoribb neuroglialis agysejtek, amelyek hozzájárulnak a hegek kialakulásához a sérülésekre - közvetlenül átprogramozhatók in vivo, hogy funkcionális idegsejtekké váljanak, amelyek hálózatokat képeznek egerekben anélkül, hogy sejtátültetésre lenne szükség. A kutatók közel egy évig követték az egereket a daganatképződés jeleinek keresésére, és arról számoltak be, hogy nem találtak. Ugyanezek a kutatók a hegképző asztrocitákat őssejtekké alakították, amelyeket neuroblasztoknak neveztek, és amelyek a sérült felnőtt gerincvelő idegsejtjeivé regenerálódtak.

Oligodendrocita prekurzor sejtek

A mielin nélkül az idegsejtek szigetelésére az idegjelek gyorsan elveszítik erejüket. A myelint megtámadó betegségek, mint például a szklerózis multiplex, idegjeleket eredményeznek, amelyek nem terjedhetnek idegvégződésekre, és ennek következtében kognitív, motoros és érzékszervi problémákhoz vezetnek. Ígéretes potenciális terápiás válasz az oligodendrocita prekurzor sejtek (OPC) transzplantációja , amely sikeresen mielinhüvelyeket hozhat létre az idegsejtek körül. Az egér és patkány fibroblasztok oligodendroglialis sejtekké történő közvetlen átalakulása potenciális OPC -forrást biztosít. Mind a nyolc, mind a három Sox10, Olig2 és Zfp536 transzkripciós faktor kényszerített expressziójával történő átalakítás ilyen sejteket eredményezhet.

Kardiomiociták

A sejtalapú in vivo terápiák transzformatív megközelítést nyújthatnak az ér- és izomnövekedés fokozásához, valamint a nem kontraktilis hegek kialakulásának megelőzéséhez transzkripciós faktorok vagy mikroRNS-ek szívbe juttatásával. A szívfibroblasztokat, amelyek az emlős szív sejtjeinek 50% -át képviselik , in vivo át lehet programozni kardiomiocita -szerű sejtekbe a szívmag transzkripciós faktorok (GATA4, MEF2C, TBX5 és a jobb átprogramozás, valamint az ESRRG, MESP1, Myocardin és ZFPM2) koszorúér ligálás után . Ezek az eredmények olyan terápiákat vontak maguk után, amelyek sejtátültetés nélkül közvetlenül remuscularizálhatják a szívet. Az ilyen átprogramozás hatékonysága azonban nagyon alacsonynak bizonyult, és a kapott kardiomiocita-szerű sejtek fenotípusa nem hasonlít egy érett normális kardiomiocitaéhoz. Továbbá, a szív transzkripciós faktorok sérült egér szívbe történő átültetése gyenge sejtek túlélését és a szívgének minimális expresszióját eredményezte.

Eközben előrelépés történt a szívizomsejtek in vitro kinyerésének módszereiben. A humán iPS sejtek hatékony szívdifferenciálódása olyan progenitorokat eredményezett, amelyek megmaradtak az infarktusos patkányszívben, és csökkent a szív átalakulása ischaemiás károsodás után.

A Sheng Ding vezette tudóscsoport kilenc vegyi anyagból álló koktélt (9C) használt az emberi bőrsejtek verő szívsejtekké történő transzdifferenciálására. Ezzel a módszerrel a sejtek több mint 97% -a elkezdett verni, ami a teljesen kifejlett, egészséges szívsejtek jellemzője. A kémiailag indukált kardiomiocita-szerű sejtek (ciCM-ek) egységesen összehúzódtak, és transzkriptomikus, epigenetikai és elektrofiziológiai tulajdonságaikban hasonlítottak az emberi kardiomiocitákra. Infarktusos egerek szívébe történő átültetéskor a 9C-vel kezelt fibroblasztokat hatékonyan ciCM-vé alakították, és egészséges kinézetű szívizomsejtekké fejlesztették őket a szervben. Ez a kémiai átprogramozási megközelítés további optimalizálás után egyszerű módot kínálhat olyan jelzések biztosítására, amelyek a szívizom helyi regenerálódását késztetik.

Egy másik vizsgálatban az egér infarktus modell ischaemiás kardiomiopátiáját célozták meg iPS sejt transzplantációval. Szinkronizálta a meghibásodott kamrákat, és regeneráló stratégiát kínál az újraszinkronizáció eléréséhez és a dekompenzáció elleni védelemhez a jobb bal kamrai vezetőképesség és kontraktilitás javításával, csökkent hegesedéssel és a strukturális átalakítás visszafordításával. Az egyik protokoll akár 98% -os kardiomiocita populációt generált a hPSC -kből egyszerűen a kanonikus Wnt jelátviteli útvonal meghatározott időpontokban történő modulálásával a differenciálódás során, könnyen hozzáférhető kis molekulájú vegyületek felhasználásával.

A kardiomiociták képződését szabályozó mechanizmusok felfedezése az ITD-1 gyógyszer kifejlesztéséhez vezetett, amely hatékonyan tisztítja a sejtfelszínt a II. Típusú TGF-β receptoroktól, és szelektíven gátolja az intracelluláris TGF-β jelátvitelt. Így szelektíven fokozza a nem elkötelezett mezoderma differenciálódását a szívizomsejtekhez, de nem a vaszkuláris simaizomhoz és az endothelsejtekhez.

Az egyik projektben dekellularizált egér szíveket vetettek be emberi iPSC-eredetű multipotenciális kardiovaszkuláris progenitor sejtekkel. A bevezetett sejtek a szív rekonstrukciójához vándoroltak, szaporodtak és in situ kardiomiocitákká, simaizomsejtekké és endothelsejtekké differenciálódtak. Ezenkívül a szív extracelluláris mátrixa (a szívállvány szubsztrátja) jelezte, hogy az emberi sejtek a megfelelő szívműködéshez szükséges speciális sejtekké válnak. 20 napos növekedési faktorokkal végzett perfúzió után a megmunkált szívszövetek újra verni kezdtek, és reagáltak a gyógyszerekre.

A szívfibroblasztok in situ indukált kardiomiocita-szerű sejtekbe (iCM) történő átprogramozása ígéretes stratégiát jelent a szív regenerálódásához. Az egerek három szív-transzkripciós faktornak, a GMT-nek (Gata4, Mef2c, Tbx5) és a kismolekuláknak in vivo voltak kitéve : SB-431542 (a transzformáló növekedési faktor (TGF) -β inhibitor) és az XAV939 (a WNT inhibitor) 2 hétig miokardiális infarktus után szignifikánsan javult az átprogramozás (az átprogramozási hatékonyság nyolcszorosára nőtt) és a szívműködés a csak GMT-nek kitett személyekhez képest.

Lásd még: áttekintés

Az izom őssejt fiatalítása

Az idősek gyakran progresszív izomgyengeségben és regenerációs kudarcban szenvednek , részben a p38α és p38β mitogén által aktivált kináz út aktivitásának növekedése miatt az idősödő vázizom őssejtekben. Ha az ilyen őssejteket a p38α és p38β átmeneti gátlásának vetjük alá, lágy hidrogél szubsztrátumokon végzett tenyésztéssel együtt, gyorsan kitágul és megfiatalítja őket, ami visszaadja erejüket.

Geriátriai egerekben a nyugvó műholdsejtek elveszítik a reverzibilis nyugalmat, ha visszafordíthatatlan öregedés előtti állapotba kapcsolnak , amit a p16 INK4a (más néven Cdkn2a) derepresszió okoz . Sérülés esetén ezek a sejtek nem aktiválódnak és nem tágulnak, még fiatalos környezetben sem. A p16INK4a némítás a geriatrikus műholdsejtekben visszaállítja a nyugalmi és izomregeneráló funkciókat.

A betegség modellezésében vagy a vázizomzatot célzó sejtalapú terápiákban potenciálisan alkalmazható myogén progenitorokat közvetlenül is elő lehet állítani indukált pluripotens őssejtekből szabadon lebegő gömbtenyészet (EZ gömbök) segítségével, nagy koncentrációval (100 ng/ml) kiegészített tápközegben. fibroblaszt növekedési faktor-2 ( FGF-2 ) és epidermális növekedési faktor .

Hepatociták

A májsejtek humán fibroblasztokból történő levezetésének jelenlegi protokolljaival ellentétben Saiyong Zhu és munkatársai (2014) nem generáltak iPSC -ket, hanem kis molekulákat használva rövidre programozták a pluripotenciát, hogy indukált multipotens progenitor sejt (iMPC) állapotot hozzanak létre, amelyből az endodermális progenitor sejtek és ezt követően a hepatociták (iMPC-Heps) hatékonyan differenciálódtak. Az emberi májelégtelenség immunhiányos egérmodelljébe történő átültetés után az iMPC-Heps széles körben elterjedt, és a hepatocita funkció szintje hasonló volt az emberi elsődleges felnőtt hepatocitákéhoz. Az iMPC-Heps nem képezett tumorokat, valószínűleg azért, mert soha nem léptek pluripotens állapotba.

Bélkripta - a bélhámsejtek hozzáférhető és bőséges forrása a béta -szerű sejtekké történő átalakításhoz.

Ezek az eredmények megalapozzák az egerek jelentős májrepopulációjának megvalósíthatóságát in vitro humán hepatocitákkal, ami megszünteti az autológ májsejtterápia útján már régóta fennálló akadályt.

A kis molekulákból álló koktél, az Y-27632 , A-83-01 (egy TGFβ kináz/ aktivinreceptor- szerű kináz ( ALK5 ) inhibitor) és a CHIR99021 (a GSK-3 hatékony inhibitora ) in vitro képes átalakítani a patkány és egér érett hepatocitákat. proliferációs bipotens sejtekbe - CLiP -k (kémiailag indukált máj progenitorok). A CLiP -k mind érett hepatocitákká, mind epehámsejtekké differenciálódhatnak, amelyek funkcionális ductalis struktúrákat képezhetnek. Hosszú távú tenyészetben a CLiP-k nem veszítették el proliferációs képességüket és máj differenciálódási képességüket, és újratelepíthetik a krónikusan sérült májszövetet.

Inzulint termelő sejtek

A cukorbetegség szövődményei, például a szív- és érrendszeri betegségek , a retinopátia , a neuropátia , a nephropathia és a perifériás keringési betegségek a cukorbetegség szabályozásától függenek, mivel a hasnyálmirigy béta -sejtjeiből hiányzik az inzulin , és halálosak lehetnek, ha nem kezelik őket. A cukorbetegség megértésének és gyógyításának egyik ígéretes megközelítése a pluripotens őssejtek (PSC), beleértve az embrionális őssejteket (ESC) és az indukált PCS -ket (iPSC), használata. Sajnos a humán PSC-ből származó inzulin-expresszáló sejtek inkább az emberi magzati β-sejtekhez hasonlítanak, mint a felnőtt β-sejtekhez. Ezzel szemben a felnőtt β-sejtek, a magzati β-sejtek tűnnek funkcionálisan éretlen,, ami a megemelkedett bazális glükóz szekréciót, és hiányzik a glükóz stimuláció és igazoltuk RNS-Seq amelynek transzkriptumok .

Alternatív stratégia a fibroblasztok átalakítása külön endodermális progenitor sejtpopulációkká, és a jelzőfaktorok koktéljainak felhasználásával ezen endodermális progenitor sejtek sikeres differenciálása funkcionális béta-szerű sejtekké in vitro és in vivo.

A három transzkripciós faktor , a PDX1 (a hasnyálmirigy-rügy kinövéséhez és a béta-sejtek éréséhez szükséges), az NGN3 (az endokrin prekurzor sejtek képzéséhez szükséges) és a MAFA (béta-sejt éréshez szükséges) kombináció (PNM) túlteljesítése a transzformáció átalakulásához vezethet egyes sejttípusok béta-sejtszerű állapotba. A funkcionális inzulintermelő sejtek hozzáférhető és bőséges forrása a bél . A PMN expresszió humán bél " organoidokban " stimulálja a bélhámsejtek átalakulását β-szerű sejtekké, amelyek esetleg elfogadhatók a transzplantációhoz .

Nephron progenitorok

A felnőtt proximális tubulussejteket közvetlenül transzkripciósan átprogramozták az embrionális vese nephron progenitorjaira, hat tanulságos transzkripciós faktor (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1 (EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) és Csigahomológ 2) felhasználásával. (SNAI2)), amely aktiválta a cap mesenchyme /nephron progenitor fenotípusnak megfelelő géneket a felnőtt proximális tubulus sejtvonalban. Az ilyen sejtek keletkezése a felnőttkori vesebetegségek sejtterápiáihoz vezethet . A kifejlett patkány vesékbe helyezett embrionális vese organoidok tovább fejlődhetnek és érrendszeri fejlődésen menhetnek keresztül.

Vérsejtek

Ahogy az erek elöregednek, szerkezetük és működésük gyakran kóros lesz, ezáltal számos, az életkorral összefüggő betegséghez járulnak hozzá, beleértve a szívinfarktust, az iszkémiás stroke-ot és a szívet, az agyat és az alsó végtagokat ellátó artériák érelmeszesedését. Tehát fontos cél, hogy serkentsük a véredények növekedését a járulékos keringésben, hogy megelőzzük ezen betegségek súlyosbodását. Az indukált vascularis progenitor sejtek (iVPC-k) hasznosak a sejt-alapú terápiában, amelynek célja a koszorúér-kollaterális növekedés stimulálása. Ezeket az endothelsejtek részleges átprogramozásával hozták létre. Az iVPC -k érrendszeri elkötelezettsége összefügg az endoteliális sejtek epigenetikai memóriájával, amely a növekvő erek sejtkomponenseivé teszi őket. Éppen ezért, amikor az iVPC -ket a szívizomba ültették , azok jobban behatoltak az erekbe, és jobban növelték a koszorúér -kollaterális áramlást, mint az iPSC -k, a mesenchymális őssejtek vagy a natív endothelsejtek.

Az ex vivo genetikai módosítás hatékony stratégia lehet az őssejtek működésének javítására. Például a sejtterápia, amely genetikai módosítást alkalmaz Pim-1 kinázzal (az Akt lefelé irányuló effektorja , amely pozitívan szabályozza a neovaszkulogenezist) a csontvelőből származó sejtekből vagy a szívizom meghibásodásából származó humán szív őssejtekből, javítja a tartósságot, a a szívizom hemodinamikai teljesítményének funkcionális paramétereinek javítása.

A zsírleszívást követően a zsírszövetből kivont őssejteket az artériákban és vénákban található simaizomsejtekké (iPVSMC) lehet előcsalogatni.

A humán iPS-sejtek 2D-s tenyésztési rendszere hármas marker szelekcióval ( CD34 (felszíni glikofoszfoprotein, amely a fejlődés korai embrionális fibroblasztjain expresszálódik), NP1 (receptor-neuropilin 1) és KDR (kináz-beillesztési tartományt tartalmazó receptor)) kombinálva, a A vasculogén prekurzor sejtek humán iPSC -ből endothelsejteket hoztak létre, amelyek a transzplantáció után stabil, funkcionális egér ereket képeztek in vivo, 280 napig.

Az infarktus kezeléséhez fontos megakadályozni a fibrotikus hegszövet kialakulását. Ez in vivo érhető el olyan parakrin tényezők átmeneti alkalmazásával, amelyek a natív szív progenitor őssejtek hozzájárulását a hegszövetből a kardiovaszkuláris szövetbe irányítják át. Például egy egér miokardiális infarktus modellben az emberi vaszkuláris endothelialis növekedési faktor A mRNS (VEGF-A modRNS) egyetlen intramyocardialis injekciója , amelyet úgy módosítottak, hogy elkerülje a szervezet normális védekező rendszerét, a mobilizáció miatt a szívműködés hosszú távú javulását eredményezi és az epicardialis progenitor sejtek átirányítása a kardiovaszkuláris sejttípusok felé.

Vér őssejtek

vörös vérsejtek

Az RBC transzfúzióra sok betegnél szükség van. A vörösvértestek kínálata azonban a mai napig labilis. Ezenkívül a transzfúzió veszélyezteti a fertőző betegségek átvitelét. Az in vitro generált biztonságos vörösvértestek nagy választéka segíthet a probléma megoldásában. Az ex vivo eritroid sejtek generálása alternatív transzfúziós termékeket kínálhat a jelenlegi és jövőbeli klinikai követelmények kielégítésére. A mobilizált CD34 pozitív sejtekből in vitro előállított vörösvértestek (RBC) normális túlélést mutatnak, amikor autológ recipiensbe transzfúzióba kerülnek. Az in vitro előállított vörösvértestek kizárólag magzati hemoglobint (HbF) tartalmaztak, ami megmenti ezen vörösvértestek működését. In vivo a magzatról a felnőtt hemoglobinra való áttérést figyelték meg az iPSC -kből származó, sejtes eritroid prekurzorok infúziója után . Bár a vörösvértesteknek nincsenek magjaik, és ezért nem tudnak daganatot képezni, közvetlen eritroblasztaik prekurzorai magokkal rendelkeznek. Az eritroblasztok végső érése funkcionális vörösvértestekké komplex átalakítási folyamatot igényel, amely a mag extrudálásával és egy enukleált vörösvértestek kialakulásával végződik. A sejt -átprogramozás gyakran megzavarja az enukleációt. Az in vitro generált vörösvértestek vagy eritroblasztok transzfúziója nem nyújt kellő védelmet a daganatképződés ellen.

Az aril -szénhidrogén -receptor (AhR) útvonal (amelyről kimutatták, hogy részt vesz a rákos sejtek fejlődésének elősegítésében) fontos szerepet játszik a normális vérsejtek fejlődésében. Az AhR aktiválása humán vérképző progenitor sejtekben (HP-k) a HP-k, a megakariocita- és eritroid-vonalú sejtek példátlan kiterjedését eredményezi. Lásd még: Tömör áttekintés: Az SH2B3 gén a citokin jelátvitel negatív szabályozóját kódolja, és a természetben előforduló funkcióvesztési variánsok ebben a génben növelik az RBC számot in vivo. Az SH2B3 célzott elnyomása az elsődleges humán vérképző ős- és progenitor sejtekben fokozta az in vitro eredetű vörösvértestek érését és összhozamát. Ezen túlmenően, inaktiválása SH2B3 által CRISPR / Cas9 genom szerkesztésre emberi pluripotens őssejtek engedélyezve fokozott eritroid sejt expanzió tartósított differenciálódás. (Lásd még az áttekintést.)

A vérlemezkék extrudáltak a megakariocitákból

Trombociták

A vérlemezkék segít megelőzni a vérzés trombocitopéniás betegek és thrombocythaemiás . A multitranszfúziós betegek jelentős problémája a vérlemezke -transzfúzióra való refrakter. Így klinikai értékkel bírna az a képesség, hogy a szérummentes táptalajban ex vivo vérlemezke-termékeket és HLA-antigéneket nem tartalmazó vérlemezke-termékeket állítanak elő . Egy RNS interferencia alapú mechanizmus lentivírus vektort használt a rövid hajtűs RNSi kifejezésére, amely a β2-mikroglobulin transzkriptumokat célozta meg CD34-pozitív sejtekben. A vérlemezkék 85% -os csökkenést mutattak az I. osztályú HLA antigénekben. Ezeknek a vérlemezkéknek normális funkciójuk volt in vitro

Az egyik klinikailag alkalmazható stratégia a funkcionális vérlemezkék humán iPSC-ből történő levezetésére magában foglalja a stabil, immortalizált megakariocita progenitor sejtvonalak (imMKCL-ek) létrehozását a BMI1 és a BCL-XL doxiciklin- függő túlexpresszióján keresztül . A kapott imMKCL -ek hosszabb ideig (4-5 hónap) is bővíthetők a tenyészetben, még a mélyhűtés után is . A c-MYC, a BMI1 és a BCL-XL növekvő imMKCL - ekben való túlzott expressziójának (a doxiciklin eltávolításával a tápközegből) leállítása vezetett CD42b + vérlemezkék képződéséhez, amelyek funkcionalitása hasonló a natív vérlemezkékéhez, számos vizsgálat alapján in vitro és in vivo. Thomas és munkatársai leírnak egy előremenő programozási stratégiát, amely 3 transzkripciós faktor egyidejű exogén expressziójára támaszkodik: GATA1 , FLI1 és TAL1 . Az előre programozott megakaryocyták burjánzanak és tenyészetben több hónapon megakaryocyta tisztasága 90% feletti elérő 2x10 ⁵ érett megakariociták bemenet hPSC. Funkcionális vérlemezkék keletkeznek az egész tenyészetben, lehetővé téve több transzfúziós egység gyűjtését akár egymillió kezdő hPSC -ből. Lásd még az áttekintést

Immunsejtek

A fehérvérsejtek speciális típusát , az úgynevezett citotoxikus T -limfocitákat (CTL -ket) az immunrendszer termeli, és képesek felismerni a különböző fertőző vagy daganatos sejtek felszínén lévő specifikus markereket, és ezáltal támadást indítanak a kártékonyak elpusztítására. sejtek. Ezért a funkcionális antigén-specifikus T-sejtekkel végzett immunterápia terápiás stratégiaként szolgálhat számos rák és vírusfertőzés elleni küzdelemben. A sejtforrások azonban korlátozottak, mivel kis mennyiségben természetes módon termelődnek és rövid élettartamúak.

Az antigénspecifikus CTL-ek előállításának potenciálisan hatékony megközelítése az érett immun T-sejtek iPSC-kké való visszaállítása, amelyek meghatározatlan proliferációs képességgel rendelkeznek in vitro, és szaporodásuk után rábírják őket, hogy újra differenciálódjanak T-sejtekké.

Egy másik módszer az iPSC és a kiméra antigénreceptor (CAR) technológiák kombinálásával humán T -sejteket állít elő, amelyek CD19 -re , a rosszindulatú B -sejtek által expresszált antigénre irányulnak , szövetkultúrában. A terápiás humán T -sejtek előállításának ez a megközelítése hasznos lehet a rákos immunterápiában és más orvosi alkalmazásokban.

Az invariáns természetes gyilkos T (iNKT) sejtek nagy klinikai potenciállal rendelkeznek a rákos immunterápia adjuvánsaiként . Az iNKT sejtek veleszületett T -limfocitaként működnek, és hídként szolgálnak a veleszületett és szerzett immunrendszer között . Növelik a tumorellenes válaszokat gamma-interferon (IFN-γ) termelésével . A gyűjtés, az átprogramozás/dedifferenciálás, az újradifferenciálás és az injekció megközelítését javasolták a kapcsolódó daganatok kezelésére.

A dendritikus sejtek (DC) a T-sejtek válaszainak szabályozására specializálódtak. A megfelelő genetikai módosításokkal rendelkező DC elég hosszú ideig fennmaradhat ahhoz, hogy stimulálja az antigén-specifikus CTL-t, és ezt követően teljesen megszűnik. A humán indukált pluripotens őssejtekből nyert DC-szerű antigénbemutató sejtek forrásként szolgálhatnak a vakcinázási terápiában.

A CCAAT/enhancer-kötő protein-α (C/EBPα) nagy hatékonysággal indukálja a B-sejtek makrofágokká való transzdifferenciálódását, és fokozza az iPS-sejtekbe való átprogramozást, ha együtt expresszálják az Oct4, Sox2, Klf4 és Myc transzkripciós faktorokkal. 100-szorosára nőtt az iPS-sejtek újraprogramozási hatékonysága, a lakosság 95% -át érintve. Ezenkívül a C/EBPa nagy hatékonysággal képes kiválasztott humán B-sejtes limfóma és leukémia sejtvonalakat makrofág-szerű sejtekké alakítani, ami rontja a sejtek tumorképző képességét.

A thymus hámsejtek megújítása

A csecsemőmirigy az első szerv, amely az életkor előrehaladtával romlik. Ez a zsugorodás az egyik fő oka annak, hogy az immunrendszer az életkor előrehaladtával csökken. A csecsemőmirigy hámsejt transzkripciós faktorának, az FOXN1 expressziójának csökkenése az életkorral összefüggő involúciót szabályozó mechanizmus egyik összetevőjeként szerepel.

Clare Blackburn és munkatársai azt mutatják, hogy a kialakult életkorral összefüggő thymicus involúció megfordítható, ha csak egy transzkripciós faktor-a FOXN1-kényszerített felülszabályozását hajtják végre a mirigyhámsejtekben annak érdekében, hogy elősegítsék ezeknek a sejteknek a megújulását , proliferációját és differenciálódását teljesen működőképes thymic epitheliummá. Ez a fiatalító és fokozott proliferáció kísérte túlszabályzását gének, amelyek elősegítik a sejtciklus progresszióját ( ciklin D1 , AN a p63 , FgfR2IIIb ), és hogy szükség van a timusz epiteliális sejtek elősegítő specifikus szempontjait T-sejt- fejlődés ( DII4 , Kitl , Ccl25 , CXCL12 , Cd40 , Cd80 , Ctsl , Pax1 ). A jövőben ezt a módszert széles körben alkalmazhatják az immunfunkció fokozására és a betegek gyulladásának leküzdésére a csecsemőmirigy in situ megfiatalításával .

Mezenchimális őssejtek

Indukció

A mezenchimális ős/sztróma sejteket (MSC -ket) vizsgálják a szív-, vese-, idegi-, ízületi- és csontjavítás, valamint gyulladásos állapotok és hemopoetikus kotranszplantáció területén. Ennek oka az immunszuppresszív tulajdonságaik és a mesenchymalis vonalú szövetek széles körére való differenciálódási képességük. Az MSC-ket általában felnőtt csontvelőből vagy zsírból nyerik, de ezek fájdalmas invazív beavatkozásokat igényelnek, és alacsony frekvenciájú források, a csontvelősejtek mindössze 0,001–0,01% -át teszik ki, és a zsírleszívó aspirátumok 0,05% -át teszik ki. Az autológ használat miatt aggodalomra ad okot, különösen az időseknél, akiknek leginkább szükségük van szövetjavításra, az MSC -k mennyisége és minősége a korral csökken.

IPSC -ket még százévesek sejtfiatalításával is meg lehetett szerezni. Mivel az iPSC -ket etikai korlátoktól mentesen lehet betakarítani, és a kultúra korlátlanul bővíthető, ezek előnyös MSC -források. Az SB-431542-vel végzett IPSC-kezelés gyors és egységes MSC-generációt eredményez humán iPSC -kből . (SB-431542-gátló, aktivin / TGF utak blokkolásával foszforiláció a ALK4 , ALK5 és ALK7 receptorok.) Ezek az iPS-MSC-k hiányozhatnak teratoma-képző képességét, megjelenik egy szokásos stabil kariotípus a tenyészetben, és mutatnak növekedési és differenciálódási jellemzőket nagyon hasonlítanak az elsődleges MSC -kéhez. Lehetőség van in vitro kiterjesztésre, lehetővé téve az MSC-alapú terápiákat. Az iPSC -ből származó MSC -k képesek elősegíteni a periodontális regenerációt, és ígéretes forrása a könnyen hozzáférhető őssejteknek a periodontitis klinikai kezelésében történő alkalmazásra.

Lai és mtsai., & Lu beszámolnak arról a kémiai módszerről, amellyel MSC-szerű sejteket (iMSC-ket) állítanak elő primer dermális fibroblasztokból hat kémiai inhibitor (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 és CHIR99021) segítségével 3 vagy anélkül növekedési faktorok (transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), alapvető fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) és leukémiát gátló faktor (LIF)). A kémiai koktél 6 napon belül közvetlenül átalakítja az emberi fibroblasztokat egyrétegű tenyészetű iMSC -kké, és a konverziós arány hozzávetőleg 38%volt.

Az in vivo sejtterápia mellett az emberi mesenchymális őssejtek tenyésztése in vitro felhasználható exoszómák tömeges előállítására , amelyek ideális hordozók a gyógyszer bejuttatására.

Dedifferenciált zsírsejtek

A zsírszövet bősége és viszonylag kevésbé invazív betakarítási módszerei miatt a mesenchymális őssejtek (MSC) forrása. Sajnos a zsírleszívó aspirátumok csak 0,05% MSC -ket tartalmaznak. Azonban nagy mennyiségű érett adipociták, amelyek általában elvesztették proliferatív képességeit, és ezért jellemzően dobni, könnyen izolálható a zsírszövet sejtszuszpenziót és dedifferenciáltathatók be lipid -mentes fibroblaszt-szerű sejtek, elemzi dedifferenciálódott zsír (DFAT) sejtek . A DFAT sejtek visszaállítják az aktív proliferációs képességet és kifejezik a multipotens kapacitásokat. A felnőtt őssejtekkel összehasonlítva a DFAT sejtek egyedülálló előnyöket mutatnak a bőségben, az izolációban és a homogenitásban. Megfelelő in vitro indukciós tenyészetben vagy megfelelő környezetben in vivo a DFAT -sejtek adipogén, osteogén, kondrogén és myogén potenciált mutathatnak. Emellett perivaszkuláris jellemzőket is mutathatnak, és neovaszkularizációt válthatnak ki.

Kondrogén sejtek

A porc a kötőszövet, amely a súrlódásmentes ízületi mozgásért felelős. Degenerációja végső soron az ízületi funkció teljes elvesztését eredményezi az osteoarthritis késői szakaszában . Avaszkuláris és hypocelluláris szövetként a porcnak korlátozott az önjavító képessége. A kondrociták az egyetlen sejttípus a porcokban, amelyekben az extracelluláris mátrix veszi körül őket, amelyeket kiválasztanak és összeállítanak.

A porcok előállításának egyik módja az iPS sejtekből történő indukció. Alternatív megoldásként lehetőség van arra, hogy a fibroblasztokat közvetlenül indukált kondrogén sejtekké (iChon) alakítsuk át közbenső iPS-sejtszakasz nélkül, három újraprogramozási tényező (c-MYC, KLF4 és SOX9) beillesztésével. A humán iChon sejtek a chondrocyták (II. Típusú kollagén) markergénjeit fejezték ki, de a fibroblasztokat nem.

Patkányok ízületi porcában kialakult hibákba ültetve az emberi iChon sejtek túléltek, és legalább négy hétig porcszövetet képeztek, daganatok nélkül. A módszer a c-MYC-t használja, amelyről úgy gondolják, hogy nagy szerepe van a daganatképződésben, és retrovirust alkalmaz az újraprogramozási tényezők bevezetésére, kizárva azt a humán terápia módosítatlan felhasználásától.

A sejtek forrásai az átprogramozáshoz

Az átprogramozás leggyakrabban használt forrásai a vérsejtek és a fibroblasztok, amelyeket a bőr biopsziájával nyernek, de a sejtek vizeletből történő kivétele kevésbé invazív. Ez utóbbi módszer nem igényel biopsziát vagy vérvételt. 2013-tól a vizeletből származó őssejteket teratomák kialakulása nélkül differenciálták endoteliális, osteogen, kondrogén, adipogén, csontváz myogén és neurogén vonalra. Ezért epigenetikai memóriájuk alkalmas az iPS sejtekbe történő átprogramozásra. Azonban kevés sejt jelenik meg a vizeletben, csak alacsony konverziós hatékonyságot értek el, és a bakteriális szennyeződés kockázata viszonylag magas.

Egy másik ígéretes forrás a sejtek újraprogramozásához az emberi szőrtüszőkből származó mezenchimális őssejtek.

Az újraprogramozáshoz használt szomatikus sejtek eredete befolyásolhatja az újraprogramozás hatékonyságát, a kapott indukált őssejtek funkcionális tulajdonságait és a tumorképző képességet.

Az IPSC -k epigenetikus memóriát őriznek származási szövetükről, ami befolyásolja differenciálódási potenciáljukat. Ez az epigenetikai memória nem feltétlenül nyilvánul meg a pluripotencia szakaszban - a különböző szövetekből származó iPSC -k megfelelő morfológiával rendelkeznek, pluripotencia markereket fejeznek ki, és képesek in vitro és in vivo a három embrionális rétegre differenciálódni. Ez az epigenetikai memória azonban megnyilvánulhat a specifikus sejttípusokká való újra differenciálódás során, amelyek megkövetelik a maradék epigenetikai jeleket hordozó specifikus lókuszokat.

Lásd még

Hivatkozások

További irodalom