Endonukleáz - Endonuclease
Az endonukleázok olyan enzimek, amelyek hasítják a foszfodiészter kötést egy polinukleotidláncban . Egyesek, mint például az I. dezoxiribonukleáz , viszonylag nem specifikusan (a szekvenciától függetlenül) vágják a DNS-t, míg sok, általában restrikciós endonukleáznak vagy restrikciós enzimnek nevezett , csak nagyon specifikus nukleotidszekvenciákon hasít. Az endonukleázok különböznek az exonukleázoktól , amelyek a felismerési szekvenciák végét hasítják a középső (endo) rész helyett. Néhány " exo-endonukleáz " néven ismert enzim azonban nem korlátozódik egyik nukleáz funkcióra sem, mind endo-, mind exo-jellegű tulajdonságokkal rendelkezik. A bizonyítékok arra utalnak, hogy az endonukleáz aktivitása késést tapasztal az exonukleáz aktivitáshoz képest.
A restrikciós enzimek az eubacteriumokból és archaea- ból származó endonukleázok, amelyek felismernek egy adott DNS-szekvenciát. A restrikciós enzim által hasításra felismert nukleotidszekvenciát restrikciós helynek nevezzük. A restrikciós hely tipikusan körülbelül négy-hat nukleotid hosszú palindrom szekvencia lesz. A legtöbb restrikciós endonukleáz egyenetlenül hasítja a DNS-szálat, így komplementer egyszálú végek maradnak. Ezek a végek hibridizáció útján újra csatlakozhatnak, és "ragadós végeknek" nevezik őket. A párosítás után a fragmensek foszfodiészter kötéseit DNS-ligázzal lehet összekötni . Több száz restrikciós endonukleáz ismert, amelyek mindegyike egy másik restrikciós helyet támad meg. Az azonos endonukleáz által hasított DNS-fragmensek összekapcsolhatók, függetlenül a DNS eredetétől. Az ilyen DNS-t rekombináns DNS- nek nevezik ; A gének új kombinációkká történő egyesítésével képződött DNS. A restrikciós endonukleázok ( restrikciós enzimek ) hatásmechanizmusuk szerint három kategóriába sorolhatók: I. típus, II. És III. Ezek az enzimek gyakran használják genetikai engineering , hogy rekombináns DNS- be történő bevitelre bakteriális, növényi vagy állati sejtek, valamint a szintetikus biológia . Az egyik leghíresebb endonukleáz a Cas9 .
Kategóriák
Végül a restrikciós endonukleázok három kategóriája létezik, amelyek viszonylagosan hozzájárulnak a specifikus szekvenciák hasításához. Az I és III több alegységes, nagyméretű komplexek, amelyek magukban foglalják mind a endonukleázok és a metiláz tevékenységeket. Az I. típus körülbelül 1000 bázispár vagy annál nagyobb véletlenszerű helyeken hasíthat le a felismerési szekvenciából, és ehhez energiaforrásként ATP szükséges. A II. Típus kissé eltérően viselkedik, és először Hamilton Smith izolálta 1970-ben. Ezek az endonukleázok egyszerűbb változatai, és lebontási folyamataikban nincs szükség ATP-re. Néhány példa a II típusú restrikciós endonukleázok közé Bam HI, Eco RI, Eco RV, Hin HindIII, és Hae III. A III. Típus azonban körülbelül 25 bázispárnál hasítja a DNS-t a felismerési szekvenciától, és a folyamathoz ATP-re is szükség van.
Jelölések
A restrikciós endonukleázok általánosan használt jelölése a " Vwx yZ" formájú , ahol a " Vwx " dőlt betűvel a nemzetség első betűje és a faj első két betűje, ahol ez a restrikciós endonukleáz megtalálható, például: Escherichia coli , Eco és Haemophilus influenzae , Hin . Ezt követi az opcionális, nem dőlt „Y” szimbólum, ami azt jelzi, hogy milyen típusú vagy törzs azonosítása, például Eco R Escherichia coli törzsek ellátott gyógyszer-rezisztencia transzfer faktor RTF-1, Eco B E. coli törzs B és Hin d a H. influenzae d törzs esetében . Végül, ha egy adott típusnak vagy törzsnek több különböző restrikciós endonukleáza van, ezeket római számokkal azonosítjuk, így a H. influenzae d törzsből származó restrikciós endonukleázokat Hin dI, Hin dII, Hin dIII stb. Elnevezéssel látjuk el . Egy másik példa: " Hae A II "és a" Hae III "a Haemophilus aegyptius baktériumra (törzs nincs meghatározva), a II. És a III. Számú restrikciós endonukleázra utal . A molekuláris biológiában alkalmazott restrikciós enzimek általában 4-8 bázispár rövid célszekvenciákat ismernek fel. Például az Eco RI enzim felismeri és hasítja az 5 '- GAATTC - 3' szekvenciát.
A restrikciós endonukleázok többféle típusúak. A restrikciós endonukleázhoz tipikusan felismerési hely és hasítási mintázat szükséges (tipikusan nukleotidbázisok: A, C, G, T). Ha a felismerési hely kívül esik a hasítási mintázat tartományán, akkor a restrikciós endonukleázra I. típusként hivatkozunk. Ha a felismerési szekvencia átfedésben van a hasítási szekvenciával, akkor a restrikciós endonukleáz restrikciós enzim a II.
További megbeszélés
Megtalálhatók olyan restrikciós endonukleázok, amelyek hasítják a standard dsDNS-t (kettős szálú DNS), vagy az ssDNS-t (egyszálú DNS), vagy akár RNS-t. Ez a vita a dsDNS-re korlátozódik; a vita azonban kiterjeszthető a következőkre:
- Standard dsDNS
- Nem szabványos DNS
- Holliday csomópontok
- Háromszálú DNS , négyszálú DNS ( G-négyszeres )
- Kétláncú DNS és RNS hibridek (az egyik szál DNS, a másik szál RNS)
- Szintetikus vagy mesterséges DNS (például nem A, C, G, T bázisokat tartalmaz, Eric T. Kool munkájára utal ). Szintetikus kodonokkal végzett kutatás, utaljon S. Benner kutatására, és a polipeptidek halmazának aminosavainak növelése, ezáltal a proteom vagy proteomika növelése - lásd P. Schultz kutatását.
Ezenkívül folyamatban vannak a szintetikus vagy mesterséges restrikciós endonukleázok létrehozására irányuló kutatások, különösen a genomon belül egyedülálló felismerési helyekkel.
A restrikciós endonukleázok vagy restrikciós enzimek általában kétféleképpen hasadnak: tompa vagy ragacsos végű minták. Példa egy I. típusú restrikciós endonukleázra.
Továbbá léteznek olyan DNS / RNS nem-specifikus endonukleázok , mint amilyenek a Serratia marcescens-ben találhatók , amelyek a dsDNS-re, az ssDNS-re és az RNS-re hatnak.
DNS javítás
Az endonukleázok szerepet játszanak a DNS helyreállításában. Az AP endonukleáz specifikusan a DNS metszését kizárólag az AP helyeken katalizálja, ezért előkészíti a DNS-t a későbbi kivágáshoz, helyrehozó szintézishez és DNS-ligáláshoz. Például, amikor a szőrtelenítés megtörténik, ez az elváltozás hiányzó bázisú dezoxiribóz-cukrot hagy maga után. Az AP endonukleáz felismeri ezt a cukrot, és lényegében levágja a DNS-t ezen a helyen, majd lehetővé teszi a DNS-helyreállítás folytatását. Az E. coli sejtek két AP endonukleázt tartalmaznak: IV endonukleáz (endoIV) és III exonukleáz (exoIII), míg az eukariótákban csak egy AP endonukleáz található.
Gyakori endonukleázok
Az alábbiakban a közös prokarióta és eukarióta endonukleázok táblázatait mutatjuk be.
| Prokarióta enzim | Forrás | Hozzászólások |
|---|---|---|
| RecBCD enonukleáz | E. coli | Részben ATP-függő; exonukleáz is; rekombinációban és javításban működik |
| T7 endonukleáz ( P00641 ) | T7 fág (3. gén) | Elengedhetetlen a replikációhoz; az egyszálú DNS-t részesíti előnyben a kétszálú DNS helyett |
| T4 endonukleáz II ( P07059 ) | T4 fág (denA) | Hasítja a -TpC-szekvenciát, hogy 5'-dCMP-végű oligonukleotidokat kapjon; a termék lánchossza a körülményektől függően változik |
| Bal 31 endonukleáz | P. espejiana | Exonukleáz is; lehúzza a duplex DNS 3 'és 5' végét. Legalább két gyors és lassú nukleáz keveréke. |
| I. endonukleáz (endo I; P25736 ) | E. coli (endA) | Periplazmatikus elhelyezkedés; a termék átlagos lánchossza 7; gátolja a tRNS; kettős szálú DNS-törést eredményez; nicket termel, amikor tRNS-szel komplexbe kerül; az endo I mutánsok normálisan nőnek |
| Mikrokokális nukleáz ( P00644 ) | Staphylococcus | 3'-P végeket állít elő; Ca2 + szükséges; az RNS-re is hat; az egyszálú DNS-t és az AT-ban gazdag régiókat részesíti előnyben |
| II. Endonukleáz (endo VI, exo III; P09030 ) | E. coli (xthA) | Hasadás az AP helye mellett; egy 3 '-> 5' exonukleáz; foszfono-észteráz 3'-P végeken |
| Eukarióta enzim | Forrás | Hozzászólások |
| Neurospora endonukleáz | Neurospora crassa, mitokondrium | Az RNS-re is hat. |
| S1 nukleáz ( P24021 ) | Aspergillus oryzae | Az RNS-re is hat |
| P1-nukleáz ( P24289 ) | Penicillium citrinum | Az RNS-re is hat |
| Mungbab nukleáz I | mung babcsíra | Az RNS-re is hat |
| Ustilago nukleáz (Dnase I) | Ustilago maydis | Az RNS-re is hat |
| Dnase I ( P00639 ) | Szarvasmarha hasnyálmirigy | A termék átlagos lánchossza 4; kettős szál törést eredményez Mn2 + jelenlétében |
| AP endonukleáz | Nucleus, mitokondrium | Részt vesz a DNS bázis excíziós javítási útvonalában |
| Endo R | HeLa sejtek | Speciálisan a GC helyszínekre |
Mutációk
A Xeroderma pigmentosa egy ritka, autoszomális recesszív betegség, amelyet hibás UV-specifikus endonukleáz okoz. A mutációval rendelkező betegek nem képesek helyrehozni a napfény okozta DNS-károsodást.
Az sarlósejtes vérszegénység egy pontmutáció okozta betegség. A mutáció által megváltoztatott szekvencia kiküszöböli az MstII restrikciós endonukleáz felismerési helyét, amely felismeri a nukleotid szekvenciát.
A tRNS-splicing endonukleáz-mutációk pontocerebelláris hypoplasiát okoznak. A Pontocerebellar hypoplasias (PCH) a neurodegeneratív autoszomális recesszív rendellenességek csoportját képviseli, amelyet a tRNS-splicing endonukleáz komplex négy különböző alegységének három mutációja okoz.
