Proteomika - Proteomics

A proteomika a fehérjék nagyszabású vizsgálata . A fehérjék az élő szervezetek létfontosságú részei, sok funkcióval rendelkeznek. A proteóma a szervezet vagy rendszer által termelt vagy módosított fehérjék teljes halmaza. A proteomika lehetővé teszi az egyre növekvő számú fehérje azonosítását. Ez változik az idővel és a különböző követelményekkel, vagy stresszekkel kapcsolatban, amelyeken egy sejt vagy szervezet megy keresztül. A proteomika egy interdiszciplináris terület, amely nagy hasznot húzott a különböző genomprojektek, köztük a Human Genome Project genetikai információiból . Ez magában foglalja a proteómák feltárását a fehérje összetételének, szerkezetének és aktivitásának általános szintjéről, és a funkcionális genomika fontos eleme .

A proteomika általában a fehérjék és proteómák nagyszabású kísérleti elemzésére utal, de gyakran kifejezetten a fehérjetisztításra és tömegspektrometriára utal .

Történelem és etimológia

A proteomikának tekinthető fehérjék első vizsgálata 1975-ben kezdődött, a kétdimenziós gél bevezetése és az Escherichia coli baktériumból származó fehérjék feltérképezése után .

A proteóma a "fehérje" és a "genom" szavak keveréke. 1994-ben alkotta meg az akkori Ph.D hallgató, Marc Wilkins a Macquarie Egyetemen , amely 1995-ben alapította az első dedikált proteomikai laboratóriumot.

A probléma összetettsége

A genomika és a transzkriptomika után a proteomika a biológiai rendszerek tanulmányozásának következő lépése. Ez bonyolultabb, mint a genomika, mivel a szervezet genomja többé -kevésbé állandó, míg a proteómák sejtenként és időről időre különböznek. Különböző géneket különböző sejttípusokban fejeznek ki, ami azt jelenti, hogy még a sejtekben előállított fehérjék alapkészletét is azonosítani kell.

A múltban ezt a jelenséget RNS -elemzéssel értékelték, és kiderült, hogy nincs összefüggés a fehérjetartalommal. Ma már ismert, hogy az mRNS -t nem mindig alakítják át fehérjévé, és az adott mennyiségű mRNS -hez előállított fehérje mennyisége függ a géntől, amelyről átírják, és a sejt élettani állapotától. A proteomika megerősíti a fehérje jelenlétét, és közvetlen mérést biztosít annak mennyiségéről.

Fordítás utáni módosítások

Nem csak az mRNS -ből történő transzláció okoz eltéréseket, hanem sok fehérjét is sokféle kémiai módosításnak vetnek alá a transzláció után. A leggyakoribb és széles körben vizsgált transzláció utáni módosítások közé tartozik a foszforilezés és a glikozilezés. Ezen transzláció utáni módosítások közül sok kritikus a fehérje működésében.

Foszforiláció

Az egyik ilyen módosítás a foszforiláció , amely sok enzimmel és szerkezeti fehérjével történik a sejtjelzés folyamatában . A hozzáadott foszfát, hogy adott aminosavak-leggyakrabban szerin és treonin által közvetített szerin-treonin -kinázok , vagy ritkábban tirozin által közvetített tirozin kinázok -causes egy fehérje lesz a cél a kötési, vagy kölcsönhatásba lép a különálló csoportját más fehérjék felismerni a foszforilált domént.

Mivel a fehérje-foszforiláció az egyik legtöbbet vizsgált fehérje-módosítás, sok "proteomikus" erőfeszítés arra irányul, hogy meghatározza a foszforilezett fehérjék halmazát egy adott sejtben vagy szövettípusban, adott körülmények között. Ez figyelmezteti a tudóst az adott esetben aktív jelzési útvonalakra.

Ubiquitination

Az ubiquitin egy kisméretű fehérje, amelyet bizonyos fehérjeszubsztrátumokhoz az E3 ubikvitin -ligázoknak nevezett enzimek köthetnek . Annak meghatározása, hogy mely fehérjék poli-ubikvitináltak, segít megérteni, hogyan szabályozzák a fehérje útvonalait. Ez tehát egy további jogos "proteomikus" tanulmány. Hasonlóképpen, ha a kutató meghatározza, hogy az egyes ligázok melyik szubsztrátot ubikvitinálják, akkor hasznos az adott sejttípusban kifejezett ligázkészlet meghatározása.

További módosítások

A foszforilezés és az ubikvitináció mellett a fehérjék (többek között) metilezésnek , acetilezésnek , glikozilezésnek , oxidációnak és nitrozilezésnek lehetnek kitéve . Néhány fehérje ezen a módosításon megy keresztül, gyakran időfüggő kombinációkban. Ez illusztrálja a fehérjék szerkezetének és működésének tanulmányozásának lehetséges összetettségét.

Különböző fehérjéket készítenek különböző körülmények között

Egy sejt különböző fehérjekészleteket állíthat elő különböző időpontokban vagy különböző körülmények között, például fejlődés , sejtdifferenciálódás , sejtciklus vagy karcinogenezis során . A proteómák komplexitásának további növekedése, amint azt már említettük, a legtöbb fehérje képes a poszttranszlációs módosítások széles skáláján.

Ezért egy "proteomikai" tanulmány nagyon gyorsan összetetté válhat, még akkor is, ha a tanulmány témája korlátozott. Ambiciózusabb körülmények között, például amikor egy adott rák altípusra biomarkert keresnek, a proteomikus tudós dönthet úgy, hogy több rákos beteg több vérszérummintáját is megvizsgálja a zavaró tényezők minimalizálása és a kísérleti zaj figyelembevétele érdekében. Így néha bonyolult kísérleti tervekre van szükség a proteóma dinamikus összetettségének figyelembevétele érdekében.

A genomikai és proteomikai tanulmányok korlátai

A proteomika különböző okokból ad megértést, mint a genomika, számos okból:

• egy gén transzkripciós szintje csak hozzávetőlegesen becsüli a fehérje transzlációs szintjét . A bőségesen előállított mRNS gyorsan lebomlik vagy nem hatékonyan transzlálható, ami kis mennyiségű fehérjét eredményez.
• mint fentebb említettük, sok fehérje tapasztal transzláció utáni módosításokat, amelyek mélyen befolyásolják tevékenységüket; például egyes fehérjék addig nem aktívak, amíg foszforilálódnak. A poszttranszlációs módosítások tanulmányozására olyan módszereket használnak, mint a foszfoproteomika és a glikoproteomika .
• sok átirat több fehérjét eredményez alternatív splicing vagy alternatív transzláció utáni módosítások révén.
• sok fehérje komplexeket képez más fehérjékkel vagy RNS molekulákkal, és csak ezeknek a molekuláknak a jelenlétében működik.
• a fehérje lebomlási sebessége fontos szerepet játszik a fehérjetartalomban.

Reprodukálhatóság . A proteomikai kísérletek reprodukálhatóságát befolyásoló egyik fő tényező sokkal több peptid egyidejű elúciója , mint a tömegspektrométerek. Ez sztochasztikus különbségeket okoz a kísérletek között a triptikus peptidek adatfüggő megszerzése miatt. Bár a korai nagyméretű sörétes puska proteomikai elemzések jelentős eltéréseket mutattak a laboratóriumok között, feltehetően részben a laboratóriumok közötti technikai és kísérleti különbségeknek köszönhetően, a reprodukálhatóság javult az újabb tömegspektrometriai elemzések során, különösen a fehérje szintjén és az Orbitrap tömegspektrométerek használatával. Nevezetesen, a célzott proteomika megnövelt reprodukálhatóságot és megismételhetőséget mutat a puskás módszerekhez képest, bár az adatsűrűség és a hatékonyság rovására.

A fehérjék tanulmányozásának módszerei

A proteomikában számos módszer létezik a fehérjék tanulmányozására. A fehérjéket általában antitestek (immunvizsgálatok) vagy tömegspektrometria segítségével lehet kimutatni . Ha összetett biológiai mintát elemeznek, vagy nagyon specifikus antitestet kell használni a kvantitatív dot blot elemzésben (QDB), vagy biokémiai elválasztást kell használni a kimutatási lépés előtt, mivel túl sok analit van a mintában ahhoz, hogy elvégezze pontos kimutatás és számszerűsítés.

Fehérje kimutatása antitestekkel (immunvizsgálatok)

A biokémiai és sejtbiológiai vizsgálatokban bizonyos fehérjék vagy azok módosított formái elleni antitesteket használtak . Ezek a molekuláris biológusok által ma használt leggyakoribb eszközök közé tartoznak. Számos speciális technika és protokoll létezik, amelyek antitesteket használnak a fehérje kimutatására. Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati eljárást (ELISA) évtizedek óta használják a mintákban lévő fehérjék kimutatására és mennyiségi mérésére. A Western blot alkalmazható az egyes fehérjék kimutatására és mennyiségi meghatározására, ahol a kezdeti lépésben egy komplex fehérje keveréket szétválasztunk SDS-PAGE segítségével , majd egy antitest segítségével azonosítjuk a kérdéses fehérjét.

A módosított fehérjéket az adott módosításra specifikus antitest kifejlesztésével lehet tanulmányozni . Például vannak olyan antitestek, amelyek csak akkor ismerik fel bizonyos fehérjéket, ha tirozin- foszforilezett , és foszfo-specifikus antitestek. Ezenkívül léteznek más módosításokra specifikus antitestek. Ezek felhasználhatók a kérdéses módosításon átesett fehérjék halmazának meghatározására.

Az immunvizsgálatokat elvégezhetjük rekombináns úton előállított immunglobulin -származékok vagy szintetikusan tervezett fehérjeállványok alkalmazásával is, amelyeket magas antigén -specifitás alapján választunk ki. Az ilyen kötőanyagok közé tartoznak az egydoménes antitestfragmensek (Nanobodies), a tervezett ankirin ismétlődő fehérjék (DARPins) és az aptamerek.

A betegségek molekuláris szintű felismerése hajtja a korai diagnózis és kezelés feltörekvő forradalmát. A terület előtt álló kihívás az, hogy a korai diagnózishoz szükséges fehérje biomarkerek nagyon kis mennyiségben lehetnek jelen. A hagyományos immunológiai vizsgálati technológia észlelésének alsó határa a felső femtomoláris tartomány ( ^10-13 M). Digitális immunoassay technológia javult detektálás érzékenységét három naplóba, hogy a attomolar tartományban (10 ^-16 M). Ez a képesség új fejlesztéseket nyithat meg a diagnosztikában és a terápiában, de az ilyen technológiákat kézi eljárásokba helyezték át, amelyek nem alkalmasak a hatékony rutinszerű használatra.

Antitestmentes fehérje kimutatása

Míg a fehérje kimutatása antitestekkel még mindig nagyon gyakori a molekuláris biológiában, más módszereket is kifejlesztettek, amelyek nem támaszkodnak antitestre. Ezek a módszerek számos előnnyel járnak, például gyakran képesek meghatározni egy fehérje vagy peptid szekvenciáját, nagyobb áteresztőképességűek lehetnek, mint az antitest-alapúak, és néha képesek azonosítani és számszerűsíteni azokat a fehérjéket, amelyekre nincs antitest.

Észlelési módszerek

A fehérjeanalízis egyik legkorábbi módszere az Edman -lebontás volt (1967 -ben vezették be), ahol egyetlen peptidet többszörös kémiai lebontásnak vetnek alá annak szekvenciájának feloldása érdekében. Ezeket a korai módszereket többnyire olyan technológiák váltották fel, amelyek nagyobb teljesítményt kínálnak.

A közelmúltban alkalmazott módszerek tömegspektrometrián alapuló technikákat alkalmaznak, ezt a fejlesztést az 1980 -as években kifejlesztett "lágy ionizációs" módszerek, például mátrix -asszisztált lézeres deszorpció/ionizáció (MALDI) és elektrospray -ionizáció (ESI) tette lehetővé . Ezek a módszerek létrehozták a felülről lefelé és az alulról felfelé irányuló proteomikai munkafolyamatokat, ahol gyakran további elválasztást végeznek az elemzés előtt (lásd alább).

Elválasztási módszerek

A komplex biológiai minták elemzéséhez a minta összetettségének csökkentésére van szükség. Ezt offline vagy egydimenziós vagy kétdimenziós elválasztással is el lehet végezni . Újabban olyan online módszereket fejlesztettek ki, amelyekben az egyes peptideket (alulról felfelé irányuló proteomikai megközelítésekben) fordított fázisú kromatográfiával választják szét, majd közvetlenül ionizálják ESI segítségével ; az elválasztás és elemzés közvetlen összekapcsolása magyarázza az "on-line" elemzés fogalmát.

Hibrid technológiák

Számos hibrid technológia létezik, amelyek az egyes analitok antitest-alapú tisztítását használják, majd tömegspektrometriai elemzést végeznek az azonosításhoz és a mennyiségi meghatározáshoz. Ilyen módszerek például a Randall Nelson által 1995-ben kifejlesztett MSIA (tömegspektrometrikus immunoassay) és a SISCAPA (Stable Isotope Standard Capture with Anti-Peptide Antibodies) módszer, amelyet Leigh Anderson vezetett be 2004-ben.

A jelenlegi kutatási módszerek

Fluoreszcens kétdimenziós differenciális gélelektroforézis (2-D DIGE) alkalmazható a 2-D DIGE folyamat eltéréseinek számszerűsítésére és statisztikailag érvényes küszöbértékek megállapítására a minták közötti mennyiségi változások hozzárendeléséhez.

Az összehasonlító proteomikai elemzés feltárhatja a fehérjék szerepét a komplex biológiai rendszerekben, beleértve a reprodukciót is. Például a triazofosz rovarölő szerrel történő kezelés növeli a barna növényvirág ( Nilaparvata lugens (Stål)) hím kiegészítő mirigyfehérjék (Acps) mennyiségét, amelyek párzás útján átvihetők a nőkre, ami növeli a termékenységet (azaz a születési arányt) a nőstények. Annak érdekében, hogy azonosítsák a hím ültetvényes nőstény növényekkel párosított kiegészítő mirigyfehérjék (Acps) és reproduktív fehérjék típusainak változásait, a kutatók összehasonlító proteomikai elemzést végeztek a párosított N. lugens nőstényekkel. Az eredmények azt mutatták, hogy ezek a fehérjék részt vesznek az N. lugens felnőtt nőstények és hímek reprodukciós folyamatában .

Az Arabidopsis peroxiszómák proteómelemzését állapították meg, mint az elfogulatlan megközelítést az új peroxiszomális fehérjék nagy léptékű azonosítására.

Számos megközelítés létezik a humán proteom jellemzésére, amely becslések szerint 20 000 és 25 000 közötti nem redundáns fehérjét tartalmaz. Az egyedi fehérjefajok száma valószínűleg 50 000 és 500 000 között fog növekedni az RNS-illesztés és a proteolízis eseményei miatt, és ha figyelembe vesszük a poszt-transzlációs módosítást is, az egyedi emberi fehérjék teljes száma becslések szerint alacsony milliókban mozog.

Ezenkívül nemrégiben beszámoltak az első ígéretes kísérletekről az állati daganatok proteómjának megfejtésére. Ezt a módszert funkcionális módszerként alkalmazták a Macrobrachium rosenbergii fehérjeprofilozás során.

Nagy teljesítményű proteomikai technológiák

A proteomika az elmúlt évtizedben folyamatosan lendületet vett, többféle megközelítés fejlődésével. Ezek közül kevesen újak, mások pedig hagyományos módszerekre építenek. A tömegspektrometrián alapuló módszerek és mikrotömbök a legelterjedtebb technológiák a fehérjék nagyszabású vizsgálatához.

Tömegspektrometria és fehérjeprofilozás

Jelenleg két tömegspektrometrián alapuló módszert alkalmaznak a fehérjék profilozására. A bevált és széles körben elterjedt módszer nagy felbontású, kétdimenziós elektroforézist alkalmaz a fehérjék különböző mintákból történő párhuzamos elválasztására, majd a tömegspektrometriával azonosítandó, differenciálisan expresszált fehérjék kiválasztása és festése. A 2-DE fejlődése és érettsége ellenére ennek is megvannak a maga korlátai. A központi gond az, hogy képtelenek feloldani a mintában lévő összes fehérjét, tekintettel azok expressziós szintjének drámai tartományára és eltérő tulajdonságaira.

A második kvantitatív megközelítés stabil izotóp címkéket használ a fehérjék megkülönböztető megjelölésére két különböző komplex keverékből. Itt a komplex keverékben lévő fehérjéket először izotóppal jelölik, majd emésztik, hogy jelzett peptideket kapjanak. A jelzett keverékeket ezután egyesítjük, a peptideket többdimenziós folyadékkromatográfiával elválasztjuk és tandem tömegspektrometriával elemezzük. Az izotóppal kódolt affinitási címke (ICAT) reagensek a széles körben használt izotópcímkék. Ennél a módszernél a fehérjék cisztein-maradékai kovalensen kötődnek az ICAT-reagenshez, ezáltal csökkentve a keverékek összetettségét, kihagyva a nem-cisztein-maradékokat.

A stabil izotóp -címkézést használó kvantitatív proteomika egyre hasznosabb eszköz a modern fejlődésben. Először is, kémiai reakciókat alkalmaztak arra, hogy címkéket vigyenek be bizonyos helyekre vagy fehérjékbe, specifikus fehérjefunkciók vizsgálata céljából. A foszforilált peptidek izolálását izotópos jelöléssel és szelektív kémiai eljárásokkal értük el, hogy megkapjuk a fehérje frakcióját a komplex keverék között. Másodszor, az ICAT technológiát használták a részlegesen tisztított vagy tisztított makromolekuláris komplexek, mint például a nagy RNS polimeráz II pre-iniciációs komplex és az élesztő transzkripciós faktorral komplexált fehérjék megkülönböztetésére. Harmadszor, az ICAT címkézést nemrégiben kombinálták kromatin izolálással, hogy azonosítsák és számszerűsítsék a kromatinnal kapcsolatos fehérjéket. Végül az ICAT reagensek hasznosak a sejtszervek és specifikus sejtfrakciók proteomikus profilozásához.

Egy másik mennyiségi megközelítés a Richard D. Smith és a Pacific Northwest National Laboratory munkatársai által kifejlesztett pontos tömeg és idő (AMT) címke megközelítés . Ebben a megközelítésben a tandem tömegspektrometria szükségességének elkerülésével, valamint a pontosan meghatározott elválasztási idő információ és a peptid- és fehérjeazonosítás nagyon pontos tömegmeghatározásának felhasználásával nagyobb áteresztőképesség és érzékenység érhető el.

Továbbfejlesztett forráson belüli töredezettségi tömegspektrometria

A tandem tömegspektrometrián alapuló proteomika alternatívájaként a forráson belüli töredezettségi tömegspektrometriát bizonyították a fehérjék azonosítására, a PTM jellemzésére és a mennyiségi meghatározásra (Q-MRM).

Fehérje chips

A tömegspektrométerek használatának kiegyensúlyozása a proteomikában és az orvostudományban a fehérje mikrotömbök használata. A fehérje mikro tömbök mögött az a cél, hogy több ezer fehérje detektáló funkciót nyomtassanak ki a biológiai minták kihallgatására. Az antitest -tömbök egy példa arra, hogy különböző antitestek sokasága van elrendezve, hogy kimutassák antigénjeiket emberi vérmintából. Egy másik megközelítés a többféle fehérjetípus tömörítése olyan tulajdonságok tanulmányozására, mint a fehérje-DNS, fehérje-fehérje és fehérje-ligandum kölcsönhatások. Ideális esetben a funkcionális proteomikus tömbök egy adott szervezet fehérjéinek teljes komplementjét tartalmazzák. Az ilyen tömbök első változata 5000 tisztított fehérjéből állt, amelyeket élesztőből üvegmikroszkópos lemezekre helyeztek. Az első chip sikere ellenére a fehérjetömbök megvalósítása nagyobb kihívást jelentett. A fehérjék eredendően sokkal nehezebben kezelhetők, mint a DNS. Széles dinamikatartományúak, kevésbé stabilak, mint a DNS, és szerkezetüket nehéz megőrizni üveglemezeken, bár elengedhetetlenek a legtöbb vizsgálathoz. A globális ICAT technológia feltűnő előnyökkel rendelkezik a fehérjechip technológiákkal szemben.

Fordított fázisú fehérje mikrotömbök

Ez egy ígéretes és újabb microarray alkalmazás olyan komplex betegségek, mint a rák diagnosztizálására, tanulmányozására és kezelésére. A technológia egyesíti a lézerfogó mikrodiszekciót (LCM) a mikrotömb technológiával, és fordított fázisú fehérje-mikrotömböket állít elő. Az ilyen típusú mikrotömbökben a teljes fehérjegyűjtemény immobilizálódik azzal a szándékkal, hogy rögzítse a betegség különböző stádiumait egy betegben. Ha LCM -mel használják, a fordított fázisú tömbök figyelemmel kísérhetik a proteom ingadozó állapotát a különböző sejtpopulációk között az emberi szövet egy kis területén belül. Ez hasznos a sejtjelző molekulák állapotának profilozásához, a szövet keresztmetszetében, amely normál és rákos sejteket is tartalmaz. Ez a megközelítés hasznos a normál prosztatahám és az invazív prosztatarák -szövetek kulcsfontosságú tényezőinek állapotának nyomon követésében. Az LCM ezután boncolja ezeket a szövet- és fehérje -lizátumokat nitrocellulóz -lemezekre, amelyeket specifikus antitestekkel vizsgáltak. Ez a módszer képes nyomon követni mindenféle molekuláris eseményt, és összehasonlítani a beteg és egészséges szöveteket ugyanazon a betegen belül, lehetővé téve a kezelési stratégiák és a diagnózis kialakítását. Az a képesség, hogy a szomszédos sejtpopulációkról proteomikai pillanatfelvételeket készítsünk, fordított fázisú mikrotömbök használatával az LCM-mel együtt számos alkalmazási lehetőséget kínál a daganatok vizsgálatán túl. Ez a megközelítés betekintést nyújthat az összes szövet normális fiziológiájába és patológiájába, és felbecsülhetetlen értékű a fejlődési folyamatok és anomáliák jellemzéséhez.

Praktikus alkalmazások

Új gyógyszerkutatás

Az emberi gének és fehérjék tanulmányozásából származó egyik fő fejlemény a betegségek kezelésére szolgáló potenciális új gyógyszerek azonosítása volt. Ez a genom- és proteominformációkra támaszkodva azonosítja a betegséggel kapcsolatos fehérjéket, amelyeket a számítógépes szoftverek ezután új gyógyszerek célpontjaiként használhatnak. Például, ha egy bizonyos fehérje érintett egy betegségben, annak 3D szerkezete információt szolgáltat a gyógyszerek kifejlesztésére, amelyek zavarják a fehérje hatását. Egy olyan molekula, amely illeszkedik egy enzim aktív helyéhez, de az enzim nem tudja felszabadítani, inaktiválja az enzimet. Ez az alapja az új gyógyszerkutatási eszközöknek, amelyek célja új gyógyszerek megtalálása a betegségekben résztvevő fehérjék inaktiválására. Mivel az egyének között genetikai különbségeket találnak, a kutatók elvárják, hogy ezeket a technikákat használják az egyén számára hatékonyabb személyre szabott gyógyszerek kifejlesztésére.

A proteomikát arra is használják, hogy feltárják a bonyolult növény-rovar kölcsönhatásokat, amelyek segítenek azonosítani azokat a jelölt géneket, amelyek részt vesznek a növények növényevőkkel szembeni védekező válaszában.

Interakciós proteomika és fehérjehálózatok

Az interakciós proteomika a fehérje kölcsönhatások elemzése a bináris interakciók skáláitól a proteom- vagy hálózatszintűig. A legtöbb fehérje a fehérje -fehérje kölcsönhatásokon keresztül működik , és az interakciós proteomika egyik célja a bináris fehérje -kölcsönhatások , fehérjekomplexek és interaktómák azonosítása .

Számos módszer áll rendelkezésre a fehérje -fehérje kölcsönhatások vizsgálatára . Míg a legnépszerűbb módszer az élesztő két hibrid analízise , egy hatékony új módszer az affinitás tisztítás , amelyet fehérje tömegspektrometria követ, címkés fehérjecsalik használatával . Más módszerek közé tartozik a felszíni plazmonrezonancia (SPR), a fehérje mikrotömbök , a kettős polarizációjú interferometria , a mikroméretű termoforézis és a kísérleti módszerek, például a fágkijelzés és az in silico számítási módszerek.

A fehérje-fehérje kölcsönhatások ismerete különösen hasznos a biológiai hálózatok és rendszerbiológia szempontjából , például a sejtjelző kaszkádokban és a génszabályozó hálózatokban (GRN, ahol a fehérje-DNS kölcsönhatások ismerete is informatív). A fehérjék interakcióinak proteomszintű elemzése és ezen interakciós minták integrálása a nagyobb biológiai hálózatokba döntő fontosságú a rendszerszintű biológia megértése szempontjából .

Kifejezési proteomika

Az expressziós proteomika magában foglalja a fehérje expresszió nagyobb léptékű elemzését . Segít azonosítani a fő fehérjéket egy adott mintában, és azokat a fehérjéket, amelyek differenciáltan kifejeződnek a kapcsolódó mintákban - például a beteg és az egészséges szövetekben. Ha egy fehérje csak a beteg mintában található, akkor hasznos gyógyszercél vagy diagnosztikai marker lehet. Az azonos vagy hasonló expressziós profillal rendelkező fehérjék funkcionálisan rokonok is lehetnek. Vannak olyan technológiák, mint a 2D-PAGE és a tömegspektrometria , amelyeket az expressziós proteomikában használnak.

Biomarkerek

Az Országos Egészségügyi Intézetek úgy határozták meg a biomarkert, mint "olyan jellemzőt, amelyet objektíven mérnek és értékelnek, mint a normális biológiai folyamatok, a patogén folyamatok vagy a terápiás beavatkozásra adott farmakológiai válaszok mutatóját".

A proteóm megértése, az egyes fehérjék szerkezete és funkciója, valamint a fehérje -fehérje kölcsönhatások összetettsége kritikus fontosságú a jövőben a leghatékonyabb diagnosztikai technikák és betegségkezelések kifejlesztéséhez. Például a proteomika rendkívül hasznos a jelölt biomarkerek (a diagnózis szempontjából értékes testfolyadékokban lévő fehérjék) azonosításában, az immunválasz által megcélzott bakteriális antigének azonosításában, valamint a fertőző vagy daganatos betegségek lehetséges immunhisztokémiai markereinek azonosításában .

A proteomika érdekes felhasználása a specifikus fehérje biomarkerek használata a betegségek diagnosztizálására. Számos technika lehetővé teszi egy adott betegség során előállított fehérjék tesztelését, ami segít a betegség gyors diagnosztizálásában. A technikák közé tartozik a Western blot , az immunhisztokémiai festés , az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA) vagy a tömegspektrometria . A Secretomics , a proteomika alterülete, amely a kiválasztott fehérjéket és a szekréciós útvonalakat tanulmányozza proteomikus megközelítések alkalmazásával, a közelmúltban fontos eszközként jelent meg a betegségek biomarkereinek felfedezésében.

Proteogenomika

A proteogenomikában olyan proteomikai technológiákat használnak, mint a tömegspektrometria a gén -annotációk javítására . A genom és a proteóma párhuzamos elemzése megkönnyíti a poszt-transzlációs módosítások és proteolitikus események felfedezését, különösen több faj összehasonlításakor (összehasonlító proteogenomika).

Szerkezeti proteomika

A strukturális proteomika magában foglalja a fehérje szerkezetek nagyszabású elemzését. Összehasonlítja a fehérje szerkezetét, és segít azonosítani az újonnan felfedezett gének funkcióit. A szerkezeti elemzés segít megérteni azt is, hogy hol kötődnek a gyógyszerek a fehérjékhez, és azt is megmutatja, hogy a fehérjék hol lépnek kölcsönhatásba egymással. Ezt a megértést különböző technológiák, például röntgenkristályos vizsgálat és NMR-spektroszkópia segítségével érik el.

Bioinformatika a proteomikához (proteome informatika)

Sok proteomikai adatot nagy teljesítményű technológiák, például tömegspektrometria és microarray segítségével gyűjtünk be. Gyakran hetekbe vagy hónapokba telik az adatok elemzése és kézi összehasonlítás. Emiatt a biológusok és vegyészek együttműködnek informatikusokkal és matematikusokkal, hogy programokat és csővezetéket hozzanak létre a fehérjeadatok számítási elemzéséhez. A bioinformatikai technikákat alkalmazva a kutatók gyorsabb elemzésre és adattárolásra képesek. Az ExPASy bioinformatikai erőforrás -portálon jó helyen találhat listát az aktuális programokról és adatbázisokról . A bioinformatikai alapú proteomika alkalmazásai közé tartozik az orvostudomány, a betegségek diagnosztizálása, a biomarkerek azonosítása és még sok más.

A fehérje azonosítása

A tömegspektrometria és a microarray peptidfragmentációs információt szolgáltat, de nem adja meg az eredeti mintában található specifikus fehérjék azonosítását. A specifikus fehérjeazonosítás hiánya miatt a korábbi kutatók kénytelenek voltak megfejteni a peptidfragmentumokat. A fehérjék azonosítására azonban jelenleg rendelkezésre állnak programok. Ezek a programok átveszik a tömegspektrometriából és a mikroarray -ből származó peptidszekvenciákat, és információt adnak a megfelelő vagy hasonló fehérjékről. Ez a program által megvalósított algoritmusokon keresztül történik, amelyek igazítást végeznek az ismert adatbázisokból származó fehérjékkel, mint például az UniProt és a PROSITE, hogy bizonyos fokig megjósolják, milyen fehérjék vannak a mintában.

Fehérje szerkezet

A biomolekuláris szerkezet alkotja a fehérje 3D konfigurációját. A fehérje szerkezetének megértése segíti a fehérje kölcsönhatásainak és működésének azonosítását. Korábban az volt, hogy a fehérjék 3D szerkezetét csak röntgenkristályos vizsgálat és NMR spektroszkópia segítségével lehetett meghatározni . 2017-től a Cryo-elektron mikroszkópia vezető technika, amely megoldja a kristályosodással (röntgenkristályos képzéssel) és a konformációs homályossággal (NMR) kapcsolatos nehézségeket; A felbontás 2,2Å volt 2015 -től. Most a bioinformatika révén vannak olyan számítógépes programok, amelyek bizonyos esetekben képesek megjósolni és modellezni a fehérjék szerkezetét. Ezek a programok az aminosavak kémiai tulajdonságait és az ismert fehérjék szerkezeti tulajdonságait használják fel a mintafehérjék 3D modelljének előrejelzésére. Ez lehetővé teszi a tudósok számára a fehérjék kölcsönhatásának nagyobb léptékű modellezését is. Ezenkívül az orvosbiológiai mérnökök olyan módszereket dolgoznak ki, amelyek figyelembe veszik a fehérjeszerkezetek rugalmasságát összehasonlítások és előrejelzések készítéséhez.

Fordítás utáni módosítások

A fehérjeanalízishez rendelkezésre álló legtöbb program nem olyan fehérjékhez készült, amelyek poszt-transzlációs módosításokon mentek keresztül . Néhány program elfogadja a transzláció utáni módosításokat, hogy segítse a fehérje azonosítását, de figyelmen kívül hagyja a módosítást a további fehérjeelemzés során. Fontos figyelembe venni ezeket a módosításokat, mivel befolyásolhatják a fehérje szerkezetét. A fordítás utáni módosítások számítási elemzése viszont felkeltette a tudományos közösség figyelmét. A jelenlegi transzláció utáni módosító programok csak előrejelző jellegűek. Kémikusok, biológusok és informatikusok együtt dolgoznak azon új csővezetékek létrehozásán és bevezetésén, amelyek lehetővé teszik a transzláció utáni módosítások elemzését, amelyeket kísérletileg azonosítottak a fehérje szerkezetére és működésére gyakorolt ​​hatásuk miatt.

Számítási módszerek a fehérje biomarkerek tanulmányozásához

A bioinformatika és a számítási módszerek alkalmazásának egyik példája a fehérje biomarkerek tanulmányozása. Számítógépes prediktív modellek kimutatták, hogy a terhesség alatt kiterjedt és változatos feto-anyai fehérje-kereskedelem fordul elő, és könnyen, nem invazív módon kimutatható az anyai teljes vérben. Ez a számítási megközelítés megkerülte az anyai vér magzati proteomikai elemzésének fő korlátozását, az anyai fehérjék bőségét, amelyek zavarják a magzati fehérjék kimutatását . A számítási modellek felhasználhatják az anyai teljes vérben korábban azonosított magzati gén transzkriptumokat az újszülött kifejezés átfogó proteomikus hálózatának létrehozásához . Az ilyen munka azt mutatja, hogy a terhes nő vérében kimutatott magzati fehérjék a fejlődő magzat szöveteinek és szerveinek változatos csoportjából származnak. A proteomikus hálózatok számos biomarkert tartalmaznak , amelyek a fejlődés proxyként szolgálnak, és szemléltetik ennek a technológiának a lehetséges klinikai alkalmazását a magzat normális és rendellenes fejlődésének nyomon követésére.

Információelméleti keretet is bevezettek a biomarkerek felfedezésére, integrálva a biofluid és szöveti információkat. Ez az új megközelítés kihasználja az egyes biofluidok és szövetek közötti funkcionális szinergiát, és a klinikailag szignifikáns eredmények lehetősége nem lehetséges, ha a szöveteket és a biofluidokat egyedileg veszik figyelembe. A szöveti biofluid információcsatornaként történő felfogásával jelentős biofluid proxyk azonosíthatók, majd felhasználhatók a klinikai diagnosztika irányított fejlesztéséhez. A jelölt biomarkereket ezután megjósolják az információátviteli kritériumok alapján a szöveti biofluid csatornákon. Jelentős biofluid-szövet kapcsolatok használhatók a biomarkerek klinikai validálásának priorizálására.

Feltörekvő trendek

Számos új koncepció képes javítani a proteomika jelenlegi jellemzőit. A fehérjék abszolút számszerűsítésének megszerzése és a transzláció utáni módosítások nyomon követése az a két feladat, amely befolyásolja az egészséges és beteg sejtek fehérjefunkciójának megértését. Sok sejtes esemény esetén a fehérjekoncentráció nem változik; funkciójukat inkább a poszt-transzlációs módosítások (PTM) modulálják. A PTM megfigyelésének módszerei a proteomika alulfejlett területei. A fehérje egy adott részhalmazának elemzésre történő kiválasztása lényegesen csökkenti a fehérje összetettségét, így előnyös diagnosztikai célokra, ahol a vér a kiindulási anyag. A proteomika másik fontos aspektusa, amelyre még nem tér ki, az, hogy a proteomikai módszereknek a fehérjék környezeti összefüggésben történő tanulmányozására kell összpontosítaniuk. Az élő sejtekbe bevezetett kémiai térhálósítók növekvő használata a fehérje-fehérje, fehérje-DNS és egyéb kölcsönhatások rögzítésére részben javíthatja ezt a problémát. A kihívás az, hogy megfelelő módszereket találjunk a releváns interakciók megőrzésére. A fehérje tanulmányozásának másik célja kifinomultabb módszerek kifejlesztése a fehérjék és más molekulák élő sejtekben és valós időben történő leképezésére.

Rendszerbiológia

A kvantitatív proteomika fejlődése egyértelműen lehetővé tenné a celluláris rendszerek mélyebb elemzését. A biológiai rendszerek sokféle zavarnak vannak kitéve ( sejtciklus , sejtdifferenciálódás , karcinogenezis , környezet (biofizikai) stb.). Az ezekre a zavarokra adott transzkripciós és transzlációs válaszok az inger hatására szerepet játszó proteóm funkcionális változásait eredményezik. Ezért a fehérje-bőség proteom-szintű változásainak leírása és számszerűsítése elengedhetetlen a biológiai jelenség holisztikusabb megértéséhez , az egész rendszer szintjén. Ily módon a proteomika kiegészítőnek tekinthető a genomika , a transzkriptomika , az epigenomika , a metabolomika és más -omikai megközelítések számára az integráló elemzések során, amelyek megpróbálják átfogóbban meghatározni a biológiai fenotípusokat . Példaként a The Cancer Proteome Atlas kvantitatív fehérje expressziós adatokat szolgáltat ~ 200 fehérjéről több mint 4000 tumormintában, a The Cancer Genome Atlas egyező transzkriptómiai és genomi adataival . Hasonló adathalmazok más sejttípusok, szövetben, és más fajok, különösen a mély shotgun tömegspektrometria, lesz egy roppant fontos erőforrás kutatási területeken, mint a rák biológia , fejlődési és őssejt biológia, az orvostudomány és az evolúciós biológia .

Emberi plazma proteóma

A humán plazma proteom jellemzése a proteomika színterének egyik fő céljává vált, de az emberi szövetek közül is a legnagyobb kihívást jelentő proteómák közé tartozik. Immunoglobulint, citokineket, fehérjehormonokat és fertőzésre utaló fehérjéket tartalmaz a rezisztens hemosztatikus fehérjék mellett. Szövetszivárgási fehérjéket is tartalmaz a test különböző szövetein keresztül történő vérkeringés miatt. A vér tehát információkat tartalmaz minden szövet fiziológiai állapotáról, és hozzáférhetőségével együtt felbecsülhetetlen értékűvé teszi a vér proteómját orvosi célokra. Úgy gondolják, hogy a vérplazma proteómjának jellemzése ijesztő kihívás.

A plazma proteóm mélysége több mint 10 ¹⁰ dinamikai tartományt foglal magában a legmagasabb fehérje (albumin) és a legalacsonyabb (néhány citokin) között, és úgy gondolják, hogy ez a proteomika egyik fő kihívása. Az időbeli és térbeli dinamika tovább bonyolítja az emberi plazma proteom vizsgálatát. Egyes fehérjék forgalma gyorsabb, mint másoké, és az artéria fehérjetartalma jelentősen eltérhet a vénától. Mindezek a különbségek még a legegyszerűbb proteomikai feladatot is elérhetetlenné teszik. E probléma kezeléséhez prioritásokat kell meghatározni. Az egyik ilyen prioritás a fehérjék legjelentősebb részhalmazának rögzítése a teljes proteom között diagnosztikai eszköz létrehozása érdekében. Másodszor, mivel a rák a fehérjék fokozott glikozilációjával jár, a fehérjék ezen részére összpontosító módszerek is hasznosak. Ismét: a többparaméteres elemzés a legjobban feltárja a kóros állapotot. Ezeknek a technológiáknak a fejlődésével a betegségprofilokat folyamatosan összefüggésbe kell hozni a megfelelő génexpressziós változásokkal. A fent említett problémák miatt a plazma proteomikája továbbra is kihívást jelent. A technológiai fejlődés és a folyamatos fejlődés azonban úgy tűnik, hogy a plazmaproteomika újjáéledését eredményezi, amint azt nemrégiben a plazmaproteomprofilozásnak nevezett technológia is megmutatta. Az ilyen technológiáknak köszönhetően a kutatók képesek voltak megvizsgálni az egerek gyulladásos folyamatait, a plazma proteómák örökölhetőségét, valamint megmutatni egy ilyen gyakori életmódbeli változás, például a súlycsökkenés hatását a plazma proteomjára.

Folyóiratok

Számos folyóirat foglalkozik a proteomika és a kapcsolódó területek területével. Ne feledje, hogy a fehérjékkel foglalkozó folyóiratok általában inkább a szerkezetre és a működésre összpontosítanak, míg a proteomikai folyóiratok inkább a teljes proteómák vagy legalábbis nagy mennyiségű fehérjék nagyszabású elemzésére összpontosítanak. Néhány fontosabb alább felsorolásra kerül (kiadóikkal együtt).

• Molekuláris és celluláris proteomika ( ASBMB )
• Journal of Proteome Research ( ACS )
• Journal of Proteomics ( Elsevier )
• Proteomika ( Wiley )

Lásd még

Fehérje adatbázisok

Kutatóközpontok

• Európai Bioinformatikai Intézet
• Holland Proteomikai Központ (NPC)

Hivatkozások

Bibliográfia

Külső linkek

• Proteomikai meg Curlie