Aptamer - Aptamer

Szerkezete egy RNS aptamer specifikus biotin . Az aptamer felület és a gerinc sárga színnel látható. A biotin (gömbök) szorosan illeszkedik az RNS felületének üregébe

Az aptamerek (latinul aptus - fit és görög meros - part) oligonukleotid vagy peptid molekulák, amelyek egy meghatározott célmolekulához kötődnek. Aptamereket általában úgy hoznak létre, hogy kiválasztják őket egy nagy véletlenszerű szekvenciakészletből , de természetes aptamerek is léteznek a riboswitch -ekben . Az Aptamereket alapkutatási és klinikai célokra egyaránt fel lehet használni makromolekuláris gyógyszerekként. Az Aptamereket ribozimekkel kombinálhatjuk, hogy célhasonjuk jelenlétében hasítsanak . Ezeknek az összetett molekuláknak további kutatási, ipari és klinikai alkalmazásaik vannak.

Pontosabban, az aptamereket a következőkre lehet besorolni

• DNS vagy RNS vagy XNA aptamerek. Ezek (általában rövid) oligonukleotidszálakból állnak.
• Peptid -aptamerek. Egy (vagy több) rövid variábilis peptid doménből állnak, amelyek mindkét végén egy fehérjeállványhoz kapcsolódnak.

Típusok

Nukleinsav

A nukleinsav-aptamerek olyan nukleinsavfajok ( újgenerációs antitest-utánzatok ), amelyek szelektivitása megegyezik az adott célpont antitestjeivel. In vitro szelekció vagy SELEX ( a ligandumok szisztematikus evolúciója exponenciális dúsítás útján ) révén keletkeznek a kis entitásoktól, például a nehézfém-ionoktól a nagy entitásokig, például a sejtekig. Molekuláris szinten az aptamer különféle nem kovalens kölcsönhatásokon keresztül kötődik rokon célpontjához, például elektrosztatikus kölcsönhatásokhoz, hidrofób kölcsönhatásokhoz és indukált illeszkedéshez. Az Aptamerek hasznosak a biotechnológiai és terápiás alkalmazásokban, mivel molekuláris felismerési tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek vetekednek az általánosan használt biomolekulák, antitestek tulajdonságaival . A diszkriminatív felismerésen túl az aptamerek előnyöket kínálnak az antitestekkel szemben, mivel teljesen in vitro készíthetők, kémiai szintézissel könnyen előállíthatók, kívánatos tárolási tulajdonságokkal rendelkeznek, és terápiás alkalmazásokban csekély vagy nem immunogén hatásúak .

1990 -ben két laboratórium dolgozta ki egymástól függetlenül a kiválasztás technikáját: az Aranylabor, a SELEX kifejezést használva az RNS -ligandumok T4 DNS -polimeráz elleni kiválasztási folyamatához ; és a Szostak labor, megalkotva az in vitro szelekció kifejezést , kiválasztva az RNS ligandumokat különböző szerves festékek ellen. A szosztaki laboratórium megalkotta az aptamer kifejezést (a latinból apto , ami azt jelenti, hogy illeszkedik) ezekhez a nukleinsav-alapú ligandumokhoz. Két évvel később a Szostak labor és a Gilead Sciences , egymástól függetlenül, in vitro szelekciós sémákat alkalmaztak egyszálú DNS-ligandumok kifejlesztésére a szerves festékek és az emberi koaguláns, a trombin számára (lásd antitrombin aptamerek ). Úgy tűnik, nincs szisztematikus különbség az RNS és a DNS aptamerek között, kivéve a DNS nagyobb belső kémiai stabilitását.

Az in vitro szelekció fogalmát több mint húsz évvel megelőzték, amikor Sol Spiegelman Qbeta replikációs rendszert használt az önreplikáló molekula kifejlesztésének módjaként. Ezen kívül egy évvel az in vitro szelekció és a SELEX közzététele előtt Gerald Joyce az általa „irányított evolúciónak” nevezett rendszert használta a ribozim hasítási aktivitásának megváltoztatására.

Az aptamerek felfedezése óta sok kutató az aptamer szelekciót alkalmazta az alkalmazás és a felfedezés eszközeként. 2001 -ben az in vitro szelekció folyamatát J. Colin Cox automatizálta az Ellington laborban, a Texasi Egyetemen Austinban , így a kiválasztási kísérlet időtartama hat hétről három napra csökkent.

Míg a nukleinsav-ligandumok mesterséges tervezésének folyamata rendkívül érdekes a biológia és a biotechnológia számára, az aptamerek fogalmát a természeti világban még nem sikerült feltárni 2002-ig, amikor két csoport Ronald Breaker és Evgeny Nudler vezetésével felfedezett egy nukleinsav-alapú genetikai kutatást. szabályozó elem (amelyet riboswitch -nek neveztek el ), amely hasonló molekuláris felismerési tulajdonságokkal rendelkezik, mint a mesterségesen előállított aptamerek. A genetikai szabályozás új módjának felfedezése mellett ez további hitelességet kölcsönöz az „ RNS -világ ” fogalmának, amely a földi élet eredetének feltételezett időszaka.

Mind a DNS, mind az RNS aptamerek erős kötési affinitást mutatnak különböző célpontokhoz. A DNS és RNS aptamereket ugyanahhoz a célponthoz választottuk ki. Ezek közé a célpontok közé tartozik a lizozim , a trombin , a humán immunhiányos vírus transz-hatású reagáló eleme (HIV TAR), a hemin , a interferon γ , a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), a prosztata-specifikus antigén (PSA), a dopamin és a nem klasszikus onkogén, hő sokkotényező 1 (HSF1). A lizozim, a HIV TAR, a VEGF és a dopamin esetében a DNS aptamer az RNS aptamer analógja, az uracil helyett timint helyettesít. A hemin-, trombin- és γ -interferon-, DNS- és RNS -aptamereket független szelektálással választottuk ki, és egyedi szekvenciákkal rendelkeznek. Tekintettel arra, hogy az RNS -aptamerek nem minden DNS -analógja mutat funkcionalitást, a DNS és RNS -szekvencia, valamint szerkezetük és működésük közötti összefüggés további vizsgálatot igényel.

Az utóbbi időben bevezették az intelligens aptamerek és általában az intelligens ligandumok fogalmát . Leírja azokat az aptamereket, amelyeket előre meghatározott egyensúlyi ( )${\ displaystyle K _ {\ mathrm {d}}}$ , sebesség ( , ${\ displaystyle k _ {\ mathrm {off}}}$ ) állandóval és az aptamer-cél kölcsönhatás termodinamikai (ΔH, ΔS) paramétereivel választanak ki . A kinetikus kapilláris elektroforézis az intelligens aptamerek kiválasztására használt technológia. Néhány kiválasztási körben aptamereket szerez. ${\ displaystyle k _ {{mathrm {on}}}$

Az aptamer-alapú terápiák legújabb fejlesztéseit az USA Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala (FDA) által az életkorral összefüggő makuladegeneráció (AMD) kezelésében jóváhagyott első aptamer-alapú gyógyszer formájában jutalmazták, az OSI Pharmaceuticals által kínált Macugen néven . Ezenkívül a NeoVentures Biotechnology Inc. sikeresen forgalomba hozta az első aptamer alapú diagnosztikai platformot a gabona mikotoxinjainak elemzésére. Számos szerződéses vállalat fejleszt aptamereket és aptabódusokat az antitestek helyettesítésére a kutatásban, a diagnosztikai platformokon, a gyógyszerkutatásban és a terápiában.

A nem módosított aptamerek gyorsan kiürülnek a véráramból, felezési ideje percektől órákig tart, főként a nukleáz lebomlása és a szervezetből a vesék által történő kiürülés miatt, ami az aptamer eredendően alacsony molekulatömege. A módosítatlan aptamer alkalmazások jelenleg az átmeneti állapotok, például a véralvadás kezelésére vagy a szervek, például a szem kezelésére irányulnak, ahol helyi bejuttatás lehetséges. Ez a gyors eltávolítás előnyt jelenthet olyan alkalmazásokban, mint az in vivo diagnosztikai képalkotás. Példa erre egy tenascin-kötő aptamer, amelyet a Schering AG fejlesztett ki rákos képalkotáshoz. Számos módosítást, mint például a 2'-fluor-szubsztituált pirimidinek , a polietilén-glikol (PEG) kötés, stb (mindkettő alkalmazott Macugen, az FDA által jóváhagyott aptamer) állnak rendelkezésre, hogy a tudósok, amellyel módon növeli a szérum felezési az aptamerek könnyen a napi vagy akár heti időskálához.

Egy másik megközelítés az aptamerek nukleázrezisztenciájának növelésére Spiegelmerek kifejlesztése , amelyek teljes egészében egy természetellenes L-ribonukleinsav gerincből állnak. Az azonos szekvenciájú Spiegelmer ugyanolyan kötési tulajdonságokkal rendelkezik, mint a megfelelő RNS -aptamer, kivéve, ha kötődik a célmolekula tükörképéhez.

Az aptamer-alapú terápiák kifejlesztése mellett számos kutató, például az Ellington-laboratórium fejlesztett ki diagnosztikai technikákat az aptamer-alapú plazmafehérje-profilozáshoz, az úgynevezett aptamer-plazmaproteomikának . Ez a technológia lehetővé teszi a jövőbeni multi-biomarker fehérje méréseket, amelyek segíthetnek a betegségek és az egészséges állapotok diagnosztikai megkülönböztetésében.

Továbbá a Hirao labor genetikai ábécé -bővítést alkalmazott természetellenes bázispárral a SELEX -hez, és nagy affinitású DNS -aptamerek létrehozását érte el. A természetellenes ötödik bázisból származó csak néhány hidrofób kölcsönhatás jelentősen növeli az aptamer affinitását a célfehérjékhez.

Az in vitro szelekció és a SELEX kísérletek forrásaként az Ellington laboratórium kifejlesztette az Aptamer Database adatbázist, amely katalógusba hozza az összes közzétett kísérletet.

Optimer ligandumok

Az optimer ligandumok a következő generációs aptamerek. Az aptamer technológia alapján az Optimer ligandumokat iteratív in vitro szelekciós körök segítségével választják ki, hogy azonosítsák azokat a ligandumokat , amelyek nagy specificitással, alacsony keresztreaktivitással és specifikus kötési kinetikával kötődnek . A felfedezést követően tovább tervezték, hogy nagyobb stabilitást , kisebb méretet és jobb gyárthatóságot biztosítsanak . Az Optimer ligandumok javított gyártási profilja növeli a skálázhatóságot, a tételek közötti konzisztenciát és csökkenti a költségeket a standard aptamerekhez képest.

Optimer ligandumokat alkalmaznak a terápiában , a gyógyszerek bejuttatásában , a biofeldolgozásban , a diagnosztikában és az alapkutatásban .

Osztott aptamerek

A hasított aptamerek két vagy több DNS -szálból állnak, amelyek egy nagyobb szülő -aptamer szegmenseit utánozzák. Az egyes komponensszálak képessége a célok megkötésére a nick helyétől és a leányszálak másodlagos szerkezetétől függ, a legkiemelkedőbb szerkezetek a háromirányú csomópontok . A célmolekula jelenléte elősegítheti a DNS -fragmensek összeszerelését. Összeszerelés után a szálakat kémiailag vagy enzimatikusan egyetlen szálba lehet ligálni. Az analitok, amelyekhez osztott aptamereket fejlesztettek ki, az α-trombin , ATP és kokain fehérje . A hasított aptamerek a bioszenzorok potenciális sablonjai a hasított fehérjerendszerekhez hasonlóan .

Peptidek

A peptid -aptamerek mesterséges fehérjék, amelyeket meghatározott célmolekulák megkötésére választottak ki vagy terveztek. Ezek a fehérjék egy vagy több változó szekvenciájú peptidhurokból állnak, amelyeket egy fehérjeállvány mutat. Ezeket jellemzően a kombinatorikus könyvtárakból izolálják, és ezt követően gyakran irányított mutációval vagy változó régiós mutagenezis és szelekcióval javítják. In vivo a peptid -aptamerek megköthetik a sejtfehérje -célpontokat és biológiai hatásokat fejthetnek ki, beleértve a megcélzott molekulák más fehérjékkel való normális fehérje -kölcsönhatásainak zavarását . A peptid -aptamerek könyvtárait " mutagéneknek " használták , azokban a vizsgálatokban, amelyekben a kutató olyan könyvtárat vezet be, amely különböző peptid -aptamereket expresszál egy sejtpopulációban, kiválasztja a kívánt fenotípust , és azonosítja azokat az aptamereket, amelyek a fenotípust okozzák. A kutató ezután ezeket az aptamereket használja csalétekként, például élesztő két hibrid szitákon, hogy azonosítsa az aptamerek által megcélzott sejtfehérjéket. Az ilyen kísérletek azonosítják az aptamerek által megkötött bizonyos fehérjéket, és azokat a fehérje kölcsönhatásokat, amelyeket az aptamerek megzavarnak, és ez okozza a fenotípust. Ezen túlmenően, a megfelelő funkcionális csoportokkal derivatizált peptid -aptamerek specifikus poszttranszlációs módosítást okozhatnak célfehérjékben, vagy megváltoztathatják a célpontok szubcelluláris lokalizációját.

A peptid aptamerek felismerhetik a célpontokat in vitro is . A bioszenzorokban antitestek helyett alkalmazást találtak, és az inaktív és aktív fehérjeformákat egyaránt tartalmazó populációkból származó fehérjék aktív izoformáinak kimutatására szolgálnak. Az ebihalok néven ismert származékok, amelyekben a peptid aptamer "fejek" kovalensen kapcsolódnak az egyedi szekvenciájú kettős szálú DNS "farokhoz", lehetővé teszik a ritka célmolekulák számszerűsítését a keverékekben PCR segítségével (például kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval) ) DNS -farkukból.

Az aptamer variábilis régiókat alkotó peptidek ugyanazon polipeptidlánc részeként szintetizálódnak, mint az állvány, és az N- és C -végükön korlátozzák a kötődést. Ez a kettős szerkezeti korlátozás csökkenti a változó régiók által elfogadható konformációk sokféleségét, és ez a konformációs sokféleség csökkenése csökkenti a molekuláris kötés entrópikus költségeit, amikor a célponttal való kölcsönhatás miatt a változó régiók egyetlen konformációt fogadnak el. Ennek eredményeként a peptid -aptamerek szorosan köthetik célpontjaikat, kötési affinitásuk összehasonlítható az antitestek által mutatottakkal (nanomoláris tartomány).

A peptid -aptamer állványok jellemzően kicsi, rendezett, oldható fehérjék. Az első, még mindig széles körben használt állvány az Escherichia coli tioredoxin , a trxA géntermék (TrxA). Ezekben a molekulákban egyetlen változó szekvenciájú peptid jelenik meg a Gly-Pro motívum helyett a TrxA-Cys-Gly-Pro-Cys- aktív hely hurokban. A TrxA fejlesztései közé tartozik a szegéllyel rendelkező cisztein szerinek helyettesítése, amely megakadályozza a diszulfidkötés lehetséges kialakulását a hurok alján, D26A szubsztitúció bevezetése az oligomerizáció csökkentése érdekében, valamint a kodonok optimalizálása az emberi sejtekben történő expresszióhoz. A 2015 -ös felülvizsgálatok 12 és 20 másik állványt használó tanulmányokról számoltak be.

A peptid-aptamer kiválasztása különböző rendszerek segítségével történhet, de a leggyakrabban használt élesztő két hibrid rendszer . Peptid aptamerek is kiválasztható kombinatorikus peptid-könyvtárak által épített fág display és egyéb felszíni display technológiák, mint a mRNS-display , riboszóma display , a bakteriális display és élesztő kijelzőn . Ezek a kísérleti eljárások biopanning néven is ismertek . A biopanningból nyert peptidek közül a mimotópok egyfajta peptid -aptamernek tekinthetők. A kombinatorikus peptidkönyvtárakból származó összes peptidet egy speciális adatbázisban tárolták MimoDB néven .

Kimutatták a ligandum -szabályozott peptid -aptamerek (LiRPA) kiválasztását. A trimer FKBP-rapamycin-FRB struktúrán alapuló új állványfehérjéből 7 aminosavból álló peptid megjelenítésével a randomizált peptid és a célmolekula közötti kölcsönhatás szabályozható a kis molekulájú Rapamycin vagy nem immunszuppresszív analógok segítségével.

X-Aptamers

Az X-Aptamers az aptamerek új generációja, amelyek célja a rendszeres DNS/RNS-alapú aptamerek kötésének és sokoldalúságának javítása . Az X-Aptamereket természetes és kémiailag módosított DNS- vagy RNS-nukleotidok kombinációjával tervezték. Az alapmódosítások lehetővé teszik különböző funkcionális csoportok/kis molekulák beépítését X-aptamerekbe, széles felhasználási lehetőségeket nyitva meg, és nagyobb valószínűséggel kötődnek a kötődéshez, mint a standard aptamerekhez. A kiválasztott pozíciókban lévő tiofoszfát -gerincmódosítások fokozzák a nukleáz stabilitását és kötési affinitását anélkül, hogy feláldoznák a specificitást.

Az X-Aptamers új kiválasztási folyamat segítségével új funkciókat fedezhet fel. A SELEX -szel ellentétben az X-Aptamer kiválasztása nem több, ismételt PCR-amplifikációs körre támaszkodik, hanem kétlépéses gyöngyalapú felfedezési folyamatot foglal magában. Az elsődleges kiválasztási folyamat során kombinatorikus könyvtárakat hoznak létre, ahol minden gyöngy körülbelül 10^12 példányt tartalmaz egyetlen szekvenciából. A gyöngyök hordozóként működnek, ahol a kötött szekvenciák végül oldatba válnak. A másodlagos oldat lehúzási folyamatában minden célpontot egyedileg le kell húzni a kötőszekvenciákból az oldatból. A kötőszekvenciákat amplifikáljuk, szekvenáljuk és elemezzük. Az egyes célpontokhoz dúsított szekvenciákat ezután szintetizálhatjuk és jellemezhetjük. Az X-aptamereket a Raptamer Discovery Group nevű cég kereskedelmi forgalomban gyártja "Raptamers" néven.

Fejlődés

AptaBiD

Az AptaBiD vagy Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery egy technológia a biomarkerek felfedezésére. Az AptaBiD alapja az aptamer vagy az aptamerek halmazának többkörös generálása a differenciális molekuláris célpontok számára a sejteken, ami megkönnyíti a biomarkerek exponenciális kimutatását. Három fő szakaszból áll: (i) az aptamerek differenciált, többkörös kiválasztása a célsejtek biomarkereihez; (ii) a biomarkerek aptamer-alapú izolálása a célsejtekből; és (iii) a biomarkerek tömegspektrometriás azonosítása. Az AptaBiD technológia fontos jellemzője, hogy a biomarker felfedezésével egyidejűleg szintetikus affinitás szondákat (aptamereket) állít elő. Az AptaBiD -ben az aptamereket a sejtfelszíni biomarkerekhez fejlesztették ki natív állapotukban és konformációjukban. Amellett, hogy megkönnyíti a biomarker azonosítását, az ilyen aptamerek közvetlenül használhatók a sejtek izolálására, a sejtek vizualizálására és a sejtek in vivo követésére . Használhatók továbbá a sejtreceptorok aktivitásának modulálására és különböző szerek (pl. SiRNS és gyógyszerek) bejuttatására a sejtekbe.

Alkalmazások

Az Aptamers a következőképpen használható:

• Affinitás -reagensek
• Bioképes szondák
• Érzékelő reagensek
• Terápiás szerek , például pegaptanib .
• A terápiás szerek szabályozott felszabadulása
• Terápiás szállítójárművek
• Klinikai és környezeti diagnosztika

Az Aptamereket különböző kórokozók, baktériumok és vírusok ellen is előállították, beleértve az A és B influenza vírusokat, a légzőszervi vírusokat (RSV), a SARS koronavírusokat (SARS-CoV) és a SARS-CoV-2 különböző kísérleti körülmények között.

Antitestcsere

Az Aptamerek veleszületett képességgel rendelkeznek ahhoz, hogy bármilyen molekulához kötődjenek, amelyre célozzák őket, beleértve a rákos sejteket és a baktériumokat is . Egy célponthoz kötődve az aptamerek agonistaként vagy antagonistaként működhetnek. Az Aptamers olyan problémákkal küzd, amelyek korlátozzák hatékonyságukat: könnyen nukleáz enzimekkel in vivo emészthetők .

Ha természetellenes bázist adunk a szokásos aptamerhez, megnövekedhet annak képessége, hogy kötődjön a célmolekulákhoz. A második kiegészítés "mini hajtű DNS" formájában stabil és tömör szerkezetet biztosít az aptamernek, amely ellenáll az emésztésnek, és meghosszabbítja élettartamát órákról napokra.

Az apamerek kevésbé valószínű, hogy nemkívánatos immunválaszokat váltanak ki, mint az antitestek .

A terápiák szabályozott kiadása

Az aptamerek azon képessége, hogy reverzibilisen megkötik a molekulákat, például a fehérjéket, egyre nagyobb érdeklődést váltott ki a terápiás biomolekulák, például növekedési faktorok szabályozott felszabadulásának elősegítésére . Ezt úgy érhetjük el, hogy az affinitás erősségét a növekedési faktorok passzív felszabadítására hangoljuk, valamint az aktív felszabadulást olyan mechanizmusokon keresztül, mint például az aptamer komplementer oligonukleotidokkal történő hibridizációja vagy az aptamer széthúzása a sejtvonzó erők hatására.

PCR

Aptamereket már létrehozásához használt hot start funkciók PCR enzimekkel, hogy megakadályozzák a nem-specifikus amplifikáció során a telepítést és kezdeti szakaszában PCR reakciókban.

Lásd még

Hivatkozások

További irodalom

Külső linkek