Lemez diffúziós teszt - Disk diffusion test
A korongdiffúziós teszt (más néven agar-diffúziós teszt , Kirby-Bauer-teszt , korongdiffúziós antibiotikum-érzékenységi teszt , korongdiffúziós antibiotikum-érzékenységi teszt és KB-teszt ) egy tenyészeten alapuló mikrobiológiai vizsgálat, amelyet diagnosztikai és gyógyszerkutatási laboratóriumokban használnak. A diagnosztikai laboratóriumokban a vizsgálatot a beteg fertőzéséből izolált baktériumok klinikailag jóváhagyott antibiotikumokkal szembeni érzékenységének meghatározására használják. Ez lehetővé teszi az orvosok számára, hogy felírják a legmegfelelőbb antibiotikus kezelést. A gyógyszerkutató laboratóriumokban, különösen a bioprospektív laboratóriumokban a vizsgálatot biológiai anyagok (pl. Növényi kivonatok, bakteriális fermentlevek) és gyógyszerjelöltek antibakteriális aktivitásának szűrésére használják. A bioprospektív vizsgálat során a vizsgálat elvégezhető párosított baktériumtörzsekkel a dereplikáció elérése és az antibakteriális hatásmechanizmus ideiglenes azonosítása érdekében .
A diagnosztikai laboratóriumokban a vizsgálatot úgy hajtják végre, hogy az agarlemez felületét a beteg fertőzéséből izolált baktériumokkal oltják be. Ezután antibiotikum tartalmú papírkorongokat viszünk fel az agarra, és a lemezt inkubáljuk. Ha egy antibiotikum megállítja a baktériumok növekedését vagy elpusztítja a baktériumokat , akkor a lemez körül lesz egy terület, ahol a baktériumok nem nőttek fel annyira, hogy láthatóvá váljanak. Ezt hívják gátlási zónának. A bakteriális izolátum érzékenysége az egyes antibiotikumokra ezután félig számszerűsíthető, ha összehasonlítjuk ezen gátlási zónák méretét az ismert antibiotikum-érzékeny, közepesen érzékeny és rezisztens baktériumokról szóló információs adatbázisokkal. Ily módon lehetséges a beteg fertőzésének kezelésére legmegfelelőbb antibiotikum azonosítása. Bár a korongdiffúziós teszt nem használható a bakteriosztatikus és a baktericid aktivitás megkülönböztetésére, kevésbé nehézkes, mint más érzékenységi vizsgálati módszerek, például a húsleves hígítása .
A gyógyszerkutató laboratóriumokban a korongdiffúziós vizsgálatot kissé eltérően végzik, mint a diagnosztikai laboratóriumokban. Ebben az esetben nem a baktériumtörzset kell jellemezni, hanem egy tesztkivonatot (pl. Növényi vagy mikrobiális kivonatot). Az agarlemezt ezért ismert fenotípusú baktériumtörzzsel (gyakran ATCC vagy NCTC törzzsel) oltjuk be, és a vizsgálati kivonatot tartalmazó korongokat felvisszük a felületre. A gátlási méretek zónája nem használható az antibakteriális hatékonyság félkvantitatív mértékeként, mivel a különböző kivonatok különböző diffúziós jellemzőkkel rendelkező molekulákat tartalmaznak (eltérő molekulaméret , hidrofilitás stb.). A gátlási méretek zónája azonban felhasználható a dereplikáció céljaira. Ezt úgy érik el, hogy az egyes kivonatokat párosított baktériumtörzsek ellen tesztelik (pl. Sztreptomicin-érzékeny és -rezisztens törzsek a sztreptomicint tartalmazó kivonatok azonosítására). Párosított törzsek (pl vad típusú és megcélzott túltermelő törzsek) is fel lehet használni, hogy azonosítani antibakteriális hatásmechanizmusa.
Történelem
Az agardiffúziót először Martinus Beijerinck használta 1889 -ben, hogy tanulmányozza az auxinok hatását a baktériumok szaporodására. A módszert azonban számos tudós és tudományos szervezet fejlesztette ki, finomította és szabványosította az évek során, köztük George F. Reddish, Norman Heatley , James G. Vincent, Alfred W. Bauer, William MM Kirby, John C. Sherris, Hans Martin Az Ericsson, az Egészségügyi Világszervezet , a Klinikai és Laboratóriumi Szabványügyi Intézet , a Svéd Antibiotikumok Referenciacsoportja, a Deutsches Institut für Normung , a British Society for Antimicrobial Chemotherapy és mások.
Elv
A tiszta baktériumtenyészetet sóoldatban szuszpendáljuk, zavarosságát szabványosítjuk, és egyenletesen átkenjük egy agarlemezen. Ezután antibiotikummal vagy kivonattal impregnált szűrőpapír korongot helyeznek az agar felületére. A korong összetevői diffundálnak a szűrőpapírból az agarba. Ezeknek az összetevőknek a koncentrációja lesz a legnagyobb a lemez mellett, és csökkenni fog, ahogy a lemeztől való távolság növekszik. Ha az antibiotikum vagy kivonat bizonyos koncentrációban hatékony a baktériumok ellen, nem nőnek olyan telepek, ahol az agarban lévő koncentráció meghaladja vagy megegyezik a tényleges koncentrációval. Ez a gátlás zónája. Általában a nagyobb gátlási zónák korrelálnak az adott baktériumtörzs antibiotikumának vagy kivonatának minimális minimális gátló koncentrációjával (MIC). Ez alól kivételt képeznek azok az esetek, amikor az antibiotikum vagy kivonat molekulái nagyok vagy hidrofóbok, mivel ezek lassan diffundálnak az agaron.
Standard módszer
Agarlemez és oltóanyag előkészítése
A Kirby -Bauer eljárás minden aspektusa szabványosított, hogy biztosítsa a következetes és pontos eredményeket. Emiatt a laboratóriumnak be kell tartania ezeket a szabványokat. A Kirby – Bauer tesztelés során használt közegnek Mueller-Hinton agarnak kell lennie , mindössze 4 mm mélyen, 100 mm vagy 150 mm-es Petri-csészékbe öntve. Az agar pH -jának 7,2 és 7,4 között kell lennie. A bakteriális oltóanyagot úgy készítik el, hogy a húsleves -tenyészetet 0,5 McFarland -féle zavarossági standardnak megfelelően hígítják , ami körülbelül 150 millió sejt / ml -nek felel meg.
Oltás és inkubálás
Használata aszeptikus technikát , húsleves kultúra egy adott organizmus összegyűjtjük egy steril tamponnal . Abban az esetben, Gram-negatív baktériumok , a felesleges folyadékot eltávolítjuk a tampont óvatosan megnyomásával, vagy forgó ellen a belsejében a cső. A tampont ezután Mueller-Hinton agarlemezen csíkozva bakteriális pázsitot képeznek. Az egyenletes növekedés elérése érdekében az agarlemezt a tamponnal egy irányban csíkozva, 120 ° -kal elforgatva, majd újra csíkozva, további 120 ° -kal elforgatva és ismét csíkozva. Egy antibiotikum -korong adagoló segítségével specifikus antibiotikumokat tartalmazó korongokat helyeznek a lemezre. Ezt az oltást követő 15 percen belül meg kell tenni. Lánggal sterilizált csipeszeket használnak, hogy óvatosan nyomják az egyes korongokat az agarra, és biztosítsák, hogy rögzítve legyenek. A lemezeket ezután egy éjszakán át inkubáljuk , általában 35 ° C hőmérsékleten. A lemezeket az antibiotikus korongok felvitele után 15 percen belül kell inkubálni.
Alternatív módszerek
A korongdiffúziós módszer számos változatát fejlesztették ki, beleértve a kórházi diagnosztikai laboratóriumokban használt oxfordi penicillin csésze és Etest módszereket, valamint a kutatási és fejlesztési laboratóriumokban alkalmazott kútdiffúziós, hengerdiffúziós és bioautográfiai módszereket.
Oxfordi penicillin csésze módszer
A növekvő antibiotikumkoncentrációt tartalmazó korongokat az agar felületén elhelyezett baktériumpázsitra helyezzük, és a lemezeket inkubáljuk. A zóna méretét a lemez szélétől a tiszta zóna végéig mérik. A vegyes fogékonyságú populációkban az értelmezés bonyolultabb. Ezeket lineáris méretekként vagy távolságnégyzetekként ábrázoljuk, a korongokban lévő antibiotikum -koncentráció természetes logaritmusának függvényében. A MIC -t az adatokon keresztül illeszkedő lineáris regresszió nulla metszéséből határozzuk meg. Maga az elfogás a MIC logaritmusa. A regressziós egyenes meredeksége összefüggésben van az adott antibiotikum diffúziós együtthatójával az agarban.
Más képek
Az agardiffúziót először 1889 -ben használta Martinus Beijerinck .
Közeli kép az agar diffúziós teszt eredményeiről.
