Fehérje hajtogatás - Protein folding
A fehérje feltekeredést az a fizikai folyamat , amelynek során a fehérjét lánc fordították , hogy a natív háromdimenziós szerkezet , tipikusan egy „összehajtogatott” konformációt , amelyben a fehérje válik biológiailag funkcionális. Gyors és reprodukálható eljárással a polipeptid egy véletlen tekercsből hajtogatja jellegzetes háromdimenziós szerkezetét . Minden fehérje először széthajtott polipeptidként vagy véletlenszerű tekercsként létezik, miután az mRNS -szekvenciából egy lineáris aminosavláncba transzlálódott . Ebben a szakaszban a polipeptidnek nincs stabil (hosszan tartó) háromdimenziós szerkezete (az első ábra bal oldala). Amint a polipeptidláncot egy riboszóma szintetizálja , a lineáris lánc háromdimenziós struktúrájába kezd hajlani.
Sok fehérje hajtogatása még a polipeptidlánc transzlációja során is megkezdődik. Az aminosavak kölcsönhatásba lépnek egymással, hogy jól meghatározott háromdimenziós szerkezetet, az összehajtott fehérjét (az ábra jobb oldala) állítsák elő, amelyet natív állapotnak neveznek . A kapott háromdimenziós szerkezetet az aminosavszekvencia vagy az elsődleges szerkezet határozza meg ( Anfinsen dogmája ).
A helyes háromdimenziós szerkezet elengedhetetlen a működéshez, bár a funkcionális fehérjék egyes részei kibontva maradhatnak , így a fehérjék dinamikája fontos. Ha nem sikerül a natív struktúrába hajtogatni, általában inaktív fehérjék keletkeznek, de bizonyos esetekben a rosszul hajtogatott fehérjék módosított vagy toxikus funkcióval rendelkeznek. Számos neurodegeneratív és más betegségek vélhetően az okozza, hogy a felhalmozódása amiloid rostszálak által alkotott hibásan feltekeredett fehérjék. Sok allergiát egyes fehérjék helytelen összecsukása okoz, mert az immunrendszer nem termel antitesteket bizonyos fehérjeszerkezetekhez.
A fehérjék denaturálása a hajtogatott állapotból a széthajtott állapotba való átmenet folyamata . Ez történik a főzés , a égések , a proteinopathies , és más összefüggésekben.
A hajtogatási folyamat időtartama drámaian változik az érdeklődő fehérjétől függően. Ha a sejten kívül tanulmányozzuk , a leglassabban összecsukódó fehérjék sok percet vagy órát igényelnek a hajtogatáshoz, elsősorban a prolin izomerizáció miatt , és a folyamat befejezése előtt számos köztes állapoton, például ellenőrző pontokon kell áthaladniuk. Másrészt nagyon kicsi , akár 100 aminosav hosszúságú, egydoménes fehérjék jellemzően egyetlen lépésben hajtogathatók. A ezredmásodperces időskálák a normák, és a leggyorsabb ismert fehérjehajtogatási reakciók néhány mikroszekundumon belül befejeződnek.
A fehérjehajtogatási folyamat megértése és szimulálása fontos kihívás a számítástechnikai biológia számára az 1960 -as évek vége óta.
A fehérje hajtogatásának folyamata
Elsődleges szerkezet
A fehérje elsődleges szerkezete , lineáris aminosavszekvenciája határozza meg natív konformációját. A specifikus aminosavmaradékok és a polipeptidláncban elfoglalt helyük azok a meghatározó tényezők, amelyek esetében a fehérje egyes részei szorosan összecsukódnak és háromdimenziós konformációját alkotják. Az aminosav összetétele nem olyan fontos, mint a szekvencia. A hajtogatás lényeges tény azonban az, hogy minden fehérje aminosavszekvenciája tartalmazza azokat az információkat, amelyek meghatározzák mind a natív szerkezetet, mind az elérési utat. Ez nem azt jelenti, hogy a közel azonos aminosavszekvenciák mindig hasonlóan hajtogatnak. A konformációk a környezeti tényezők alapján is különböznek; hasonló fehérjék eltérően hajtogatnak attól függően, hogy hol találhatók.
Másodlagos szerkezet
A másodlagos szerkezet kialakítása az első lépés a hajtogatási folyamatban, amelyet egy fehérje megtesz, hogy felvegye natív szerkezetét. A másodlagos szerkezetre jellemzőek az alfa -hélixek és béta -lapok néven ismert szerkezetek, amelyek gyorsan összecsukódnak, mert intramolekuláris hidrogénkötések stabilizálják őket , amint azt először Linus Pauling jellemezte . Az intramolekuláris hidrogénkötések kialakulása egy másik fontos hozzájárulás a fehérje stabilitásához. Az α-hélixeket a gerinc hidrogénkötésével, spirál alakúvá alakítják (lásd a jobb oldali ábrát). A β redős lemez egy olyan szerkezet, amely úgy alakul ki, hogy a gerinc maga fölé hajlik, és hidrogénkötéseket hoz létre (amint azt a bal oldali ábra mutatja). A hidrogénkötések között az amid hidrogén és karbonilcsoport oxigénatomja peptidkötés . Léteznek párhuzamos anti β redős lemezek és párhuzamos β redős lemezek, ahol a hidrogénkötések stabilitása erősebb az anti-párhuzamos β lemezben, mivel az ideális 180 fokos szögben hidrogénkötéseket képez a párhuzamos lemezek által kialakított ferde hidrogénkötésekhez képest.
Harmadlagos szerkezet
Az alfa -hélixek és a béta redős lemezek lehetnek amfipatikus jellegűek, vagy tartalmazhatnak hidrofil és hidrofób részt. A másodlagos szerkezetek ezen tulajdonsága elősegíti a fehérje harmadlagos szerkezetét, amelyben a hajtogatás úgy történik, hogy a hidrofil oldalak a fehérjét körülvevő vizes környezet felé néznek , a hidrofób oldalak pedig a fehérje hidrofób magjához. A másodlagos struktúra hierarchikusan utat enged a harmadlagos szerkezet kialakulásának. Miután a fehérje harmadlagos szerkezete kialakult és stabilizálódott a hidrofób kölcsönhatásokkal, kovalens kötés is létrejöhet diszulfidhidak formájában, amelyek két ciszteinmaradék között keletkeznek . A fehérje harmadlagos szerkezete egyetlen polipeptidláncot tartalmaz; azonban a hajtogatott polipeptidláncok további kölcsönhatásai kvaterner szerkezet kialakulásához vezetnek.
Negyedéves szerkezet
A harmadlagos szerkezet teret adhat bizonyos fehérjékben a kvaterner szerkezet kialakulásának , ami általában magában foglalja a már összehajtott alegységek "összeszerelését" vagy "összeszerelését"; más szavakkal, több polipeptidlánc kölcsönhatásba léphet egy teljesen működőképes kvaterner fehérjévé.
A fehérje hajtogatásának hajtóereje
A hajtogatás spontán folyamat , amelyet főként a hidrofób kölcsönhatások, az intramolekuláris hidrogénkötések kialakulása , a van der Waals -erők vezérelnek , és ezt a konformációs entrópia ellenzi . A hajtogatás folyamata gyakran együtt-transzlációval kezdődik , így a fehérje N-terminálja elkezd hajtogatni, miközben a fehérje C-terminális részét még a riboszóma szintetizálja ; azonban egy fehérje molekula spontán összecsukódhat a bioszintézis során vagy azt követően . Bár ezek a makromolekulák " összecsukhatónak " tekinthetők , az eljárás függ az oldószertől ( víz vagy kétrétegű lipid ), a sók koncentrációjától , a pH -tól , a hőmérséklettől , a kofaktorok és a molekuláris chaperonok lehetséges jelenlététől is .
A fehérjék korlátozott hajtogatási képességeiket korlátozzák a lehetséges hajlítási szögek vagy konformációk. A fehérje hajtogatásának megengedett szögeit egy kétdimenziós ábrával írják le, amelyet Ramachandran-diagramnak neveznek, és a megengedett forgás psi és phi szögeivel ábrázolják.
Hidrofób hatás
A fehérje hajtogatásának termodinamikailag kedvezőnek kell lennie a sejten belül ahhoz, hogy spontán reakció legyen. Mivel ismert, hogy a fehérje hajtogatása spontán reakció, ezért negatív Gibbs -mentes energiaértéket kell feltételeznie . A Gibbs szabad energiája a fehérje -hajtogatásban közvetlenül kapcsolódik az entalpiához és az entrópiához . Ahhoz, hogy negatív delta G keletkezzen, és a fehérje hajtogatása termodinamikailag kedvezővé váljon, akkor vagy entalpiának, entrópianak, vagy mindkét feltételnek kedvezőnek kell lennie.
A víznek kitett hidrofób oldalláncok számának minimalizálása fontos hajtóereje a hajtogatási folyamatnak. A hidrofób hatás az a jelenség, amelyben egy fehérje hidrofób lánca a fehérje magjába omlik (távol a hidrofil környezettől). Vizes környezetben a vízmolekulák hajlamosak összegyűlni a fehérje hidrofób régiói vagy oldalláncai körül, és rendezett vízmolekulák vízhéjait képezik. A vízmolekulák hidrofób régió körüli rendezése növeli a rendet a rendszerben, és ezért hozzájárul az entrópia negatív változásához (kevesebb entrópia a rendszerben). A vízmolekulák ezekben a vízketrecekben vannak rögzítve, amelyek hajtják a hidrofób összeomlást vagy a hidrofób csoportok befelé hajtogatását. A hidrofób összeomlás entrópiát visz vissza a rendszerbe a vízketrecek feltörése révén, ami felszabadítja a rendezett vízmolekulákat. A gömb alakú hajtogatott fehérje magjában kölcsönhatásba lépő hidrofób csoportok sokasága jelentős mértékben hozzájárul a fehérje stabilitásához a hajtogatás után, a hatalmasan felhalmozott van der Waals erők (különösen a londoni diszperziós erők ) miatt. A hidrofób hatás csak akkor létezik hajtóerőként a termodinamikában, ha vizes közeg van jelen egy nagy hidrofób régiót tartalmazó amfifil molekulával. A hidrogénkötések erőssége a környezetüktől függ; így a hidrofób magba burkolt H-kötések jobban hozzájárulnak a natív állapot stabilitásához, mint a vizes környezetnek kitett H-kötések.
A gömb alakú redőkben lévő fehérjékben a hidrofób aminosavak inkább az elsődleges szekvencia mentén helyezkednek el, nem pedig véletlenszerűen oszlanak el vagy csoportosulnak. Azonban a nemrégiben de novo született fehérjék , amelyek hajlamosak a belső rendellenességekre , a hidrofób aminosavak csoportosulásának ellentétes mintázatát mutatják az elsődleges szekvencia mentén.
Chaperones
A molekuláris chaperonok a fehérjék egy olyan osztálya, amelyek elősegítik más fehérjék helyes összecsukását in vivo . A chaperonok minden sejtrészben léteznek, és kölcsönhatásba lépnek a polipeptidlánccal annak érdekében, hogy a fehérje natív háromdimenziós konformációja létrejöhessen; maguk a chaperonok azonban nem szerepelnek a fehérje végső szerkezetében, amelyben asszisztálnak. A chaperonok akkor is segíthetnek a hajtogatásban, ha a születő polipeptidet a riboszóma szintetizálja. A molekuláris chaperonok kötődéssel működnek, hogy stabilizálják a fehérje egyébként instabil szerkezetét a hajtogatási útvonalában, de a chaperonok nem tartalmazzák a szükséges információt ahhoz, hogy ismerjék a segített fehérje megfelelő natív szerkezetét; inkább a kísérők úgy dolgoznak, hogy megakadályozzák a helytelen összecsukható konformációkat. Ily módon a kísérők valójában nem növelik a natív szerkezet felé történő hajtogatási folyamatban részt vevő egyes lépések arányát; ehelyett a polipeptidlánc esetleges nem kívánt aggregációinak csökkentésével működnek, amelyek egyébként lelassíthatják a megfelelő intermedier keresését, és hatékonyabb utat biztosítanak a polipeptidlánc számára a megfelelő konformációk felvételéhez. A chaperonokat nem szabad összetéveszteni a hajtogató katalizátorfehérjékkel , amelyek katalizálják a hajtogatási utak lassú lépéseiért felelős kémiai reakciókat. Összecsukható katalizátorok például a fehérje- diszulfid-izomerázok és a peptidil-prolil-izomerázok , amelyek részt vehetnek a diszulfidkötések kialakításában vagy a peptidcsoport cisz- és transz-sztereoizomerjei közötti konverzióban. A chaperonokról kimutatták, hogy kritikus fontosságúak a fehérje in vivo hajtogatási folyamatában, mert a fehérjéhez megfelelő segítséget nyújtanak ahhoz, hogy a megfelelő összehangolást és konformációt elég hatékonyan elvégezzék ahhoz, hogy "biológiailag releváns" legyen. Ez azt jelenti, hogy a polipeptidlánc elméletileg a chaperonok segítsége nélkül összecsukódhat natív szerkezetébe, amint azt az in vitro végzett fehérjehajtogatási kísérletek is bizonyítják ; ez a folyamat azonban túl hatékonynak vagy túl lassúnak bizonyul a biológiai rendszerekben való létezéshez; ezért chaperonok szükségesek a fehérjék in vivo hajtogatásához . Amellett, hogy a chaperonok szerepet játszanak a natív szerkezet kialakulásának elősegítésében, a különböző szerepekben, például a fehérjetranszportban, a lebomlásban is részt vesznek, sőt bizonyos külső denaturáló tényezőknek kitett denaturált fehérjéknek lehetőséget adnak arra, hogy újra feloldódjanak a megfelelő natív szerkezetükbe.
Egy teljesen denaturált fehérjéből hiányzik mind a harmadlagos, mind a másodlagos szerkezet, és úgynevezett véletlen tekercsként létezik . Bizonyos körülmények között egyes fehérjék újra feltekeredhetnek; azonban a denaturáció sok esetben visszafordíthatatlan. A sejtek olykor a hősokk -fehérjék néven ismert enzimekkel (egyfajta chaperon) védik fehérjeiket a hő denaturáló hatása ellen , amelyek segítik a többi fehérjét a hajtogatásban és a hajtogatásban. A hősokk fehérjéket minden vizsgált fajban találták, a baktériumoktól az emberekig, ami arra utal, hogy nagyon korán fejlődtek ki, és fontos funkciójuk van. Egyes fehérjék soha nem hajlanak össze a sejtekben, kivéve olyan chaperonok segítségével, amelyek vagy izolálják az egyes fehérjéket, hogy összehajtogatásukat ne szakítsa meg más fehérjékkel való kölcsönhatás, vagy segítsen a rosszul összehajtott fehérjék kibontakozásában, lehetővé téve számukra, hogy újra a megfelelő natív szerkezetbe kerüljenek. Ez a funkció fontos, hogy megakadályozza a kockázata csapadék be oldhatatlan amorf aggregátumok. A fehérjék denaturációjában vagy a natív állapot megzavarásában szerepet játszó külső tényezők közé tartozik a hőmérséklet, a külső mezők (elektromos, mágneses), a molekuláris kiszorulás, sőt a tér korlátozása (azaz a bezártság), amelyek nagyban befolyásolhatják a fehérjék összehajtását. Az oldott anyagok magas koncentrációja , a szélsőséges pH , a mechanikai erők és a kémiai denaturálószerek jelenléte szintén hozzájárulhat a fehérjék denaturációjához. Ezeket az egyéni tényezőket stresszként csoportosítják. Kimutatták, hogy a chaperonok növekvő koncentrációban léteznek a sejtes stressz idején, és segítik a feltörekvő fehérjék, valamint a denaturált vagy rosszul összehajtogatott fehérjék megfelelő összehajtását.
Bizonyos körülmények között a fehérjék nem hajlanak biokémiailag funkcionális formájukba. A sejtek által megélni kívánt tartomány fölötti vagy alatti hőmérséklet hatására a termikusan instabil fehérjék kibontakoznak vagy denaturálódnak (ezért a forralás miatt a tojásfehérje átlátszatlanná válik). A fehérjék termikus stabilitása azonban korántsem állandó; például olyan hipertermofil baktériumokat találtak, amelyek akár 122 ° C hőmérsékleten is szaporodnak, ami természetesen megköveteli, hogy a létfontosságú fehérjék és fehérjeegységek teljes komplementje stabil legyen ezen vagy magasabb hőmérsékleten.
A baktérium E. coli van a befogadó számára a T4 bakteriofág , és a fág kódolt gp31 fehérjét ( P17313 ) úgy tűnik, hogy szerkezetileg és funkcionálisan homológ az E. coli chaperon fehérjét GroES és képes helyettesíteni azt a szerelvény T4 bakteriofág vírus részecskék során fertőzés. A GroES -hez hasonlóan a gp31 stabil komplexet képez a GroEL chaperoninnal, amely feltétlenül szükséges a g423 bakteriofág T4 fő kapszidprotein hajtogatásához és összeszereléséhez.
Hajtogatás
Egyes fehérjéknek több natív szerkezetük van, és bizonyos külső tényezők alapján megváltoztatják a hajtásukat. Például a KaiB fehérje a nap folyamán összecsukható, és a cianobaktériumok órájaként működik. Becslések szerint a PDB ( Protein Data Bank ) fehérjék körülbelül 0,5–4% -a váltja a redőket.
Fehérje hibás hajtogatás és neurodegeneratív betegség
Egy fehérje akkor tekinthető rosszul összehajtottnak, ha nem tudja elérni normális natív állapotát. Ennek oka lehet az aminosav -szekvencia mutációi vagy a normál hajtogatási folyamat külső tényezők általi megzavarása. A rosszul összehajtogatott fehérje jellemzően β-lapokat tartalmaz , amelyek szupramolekuláris elrendezésben, kereszt-β szerkezetként ismertek. Ezek a β-lapokban gazdag szerelvények nagyon stabilak, nagyon oldhatatlanok és általában ellenállnak a proteolízisnek. Ezeknek a fibrilláris szerkezeteknek a szerkezeti stabilitását a fehérje-monomerek közötti kiterjedt kölcsönhatások okozzák, amelyeket a β-szálaik közötti gerinces hidrogénkötések képeznek. A fehérjék hibás összecsukása kiválthatja a többi fehérje további hibás összecsukódását és halmozódását aggregátumokká vagy oligomerekké. Az aggregált fehérjék szintjének növekedése a sejtben amiloidszerű struktúrák kialakulásához vezet, amelyek degeneratív rendellenességeket és sejthalált okozhatnak. Az amiloidok fibrilláris szerkezetek, amelyek molekulák közötti hidrogénkötéseket tartalmaznak, amelyek nagyon oldhatatlanok és átalakított fehérjeaggregátumokból készülnek. Ezért előfordulhat, hogy a proteaszóma útvonal nem elég hatékony ahhoz, hogy lebontja a rosszul összehajtott fehérjéket az aggregáció előtt. A rosszul összehajtogatott fehérjék kölcsönhatásba léphetnek egymással, és strukturált aggregátumokat képezhetnek, és toxikussá válhatnak az intermolekuláris kölcsönhatások révén.
Az aggregált fehérjék olyan prionokkal összefüggő betegségekhez kapcsolódnak, mint a Creutzfeldt -Jakob -betegség , a szarvasmarha -szivacsos agyvelőbántalom (őrült tehén -betegség), az amiloidokkal kapcsolatos betegségek, például az Alzheimer -kór és a családi amiloid -kardiomiopátia vagy polineuropátia , valamint az intracelluláris aggregációs betegségek, például a Huntington -kór és Parkinson -kór . Ezek a korral kezdődő degeneratív betegségek összefüggésben állnak a rosszul összehajtogatott fehérjék oldhatatlan, extracelluláris aggregátumokká történő aggregációjával és/vagy intracelluláris zárványokkal, beleértve a kereszt-β amiloid fibrillákat . Nem teljesen világos, hogy az aggregátumok okozzák vagy pusztán a fehérje homeosztázis elvesztését, a szintézis, a hajtogatás, az aggregáció és a fehérjeforgalom közötti egyensúlyt. A közelmúltban az Európai Gyógyszerügynökség jóváhagyta a Tafamidis vagy a Vyndaqel (a tetramerikus transztiretin kinetikus stabilizátora) alkalmazását a transztiretin -amiloid betegségek kezelésére. Ez arra utal, hogy az amiloid fibrillák kialakulásának folyamata (és nem maguk a fibrillák) a posztmitotikus szövetek degenerációját okozza az emberi amiloid betegségekben. Misfoldingot és a túlzott lebomlását helyett összecsukható és a funkció vezet számos proteopathy betegségek, például antitripszin -asszociált emphysema , cisztás fibrózis és a lizoszomális tárolási betegségek , ahol a funkció elvesztése az eredete a rendellenesség. Míg a fehérjepótló terápiát történelmileg használták az utóbbi rendellenességek korrigálására, egy új megközelítés az, hogy gyógyszerészeti chaperonokat használnak a mutált fehérjék hajtogatására, hogy működőképessé tegyék azokat.
Kísérleti technikák a fehérje hajtogatásának tanulmányozására
Míg a fehérjék hajtogatására vonatkozó következtetéseket mutációvizsgálatokkal lehet levonni , általában a fehérje hajtogatásának tanulmányozására szolgáló kísérleti technikák a fehérjék fokozatos kibontásán vagy hajtogatásán és a konformációs változások megfigyelésén alapulnak szabványos nem kristálytani módszerek alkalmazásával.
Röntgenkristályos vizsgálat
A röntgenkristályos vizsgálat az egyik leghatékonyabb és legfontosabb módszer a hajtogatott fehérje háromdimenziós konfigurációjának megfejtésére. A röntgenkristályos vizsgálat elvégzéséhez a vizsgált fehérjét egy kristályrácson belül kell elhelyezni. Ahhoz, hogy egy fehérjét egy kristályrácsba helyezhessen, rendelkeznie kell megfelelő kristályosító oldószerrel, tiszta fehérjét kell kapnia túltelített szinteken az oldatban, és kicsapnia a kristályokat az oldatban. Miután egy fehérje kikristályosodott, a röntgennyalábokat a kristályrácson keresztül koncentrálhatjuk, ami eltereli a sugarakat, vagy különböző irányokban kifelé lő. Ezek a kilépő sugarak korrelálnak a belsejében lévő fehérje specifikus háromdimenziós konfigurációjával. A röntgensugarak kifejezetten kölcsönhatásba lépnek a fehérje kristályrácson belüli egyes atomokat körülvevő elektronfelhőkkel, és érzékelhető diffrakciós mintát hoznak létre. Csak az elektronsűrűségű felhőket a röntgensugarak amplitúdójával összekapcsolva lehet ezt a mintát kiolvasni, és feltételezésekhez vezetni az érintett fázisokról vagy fázisszögekről, amelyek bonyolítják ezt a módszert. A Fourier -transzformáció néven ismert matematikai alapon létrehozott kapcsolat nélkül a " fázisprobléma " nagyon megnehezítené a diffrakciós minták előrejelzését. A feltörekvő módszerek, mint például a többszörös izomorf helyettesítés, nehézfémionok jelenlétét használják a röntgensugarak kiszámíthatóbb módon történő diffrakciójához, csökkentve az érintett változók számát és megoldva a fázisproblémát.
Fluoreszcens spektroszkópia
A fluoreszcens spektroszkópia nagyon érzékeny módszer a fehérjék hajtogatási állapotának vizsgálatára. Három aminosav, a fenilalanin (Phe), a tirozin (Tyr) és a triptofán (Trp) belső fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkezik, de csak Tyr -t és Trp -t használnak kísérletileg, mert kvantumhozamuk elég magas ahhoz, hogy jó fluoreszcens jeleket adjon. Mind Trp -t, mind Tyr -t 280 nm hullámhossz gerjeszti, míg csak Trp -t 295 nm hullámhossz gerjeszt. Aromás jellegük miatt a Trp és Tyr aminosavak gyakran teljesen vagy részben a fehérjék hidrofób magjában találhatók, két fehérjetartomány határfelületén vagy az oligomer fehérjék alegységei közötti határfelületen. Ebben az apoláris környezetben nagy a kvantumhozamuk és ezért nagy a fluoreszcencia intenzitásuk. A fehérje harmadlagos vagy kvaterner szerkezetének megzavarása után ezek az oldalláncok jobban ki vannak téve az oldószer hidrofil környezetének, és kvantumhozamuk csökken, ami alacsony fluoreszcenciaintenzitást eredményez. A Trp -maradékok esetében a maximális fluoreszcencia -emissziójuk hullámhossza a környezettől is függ.
Fluoreszcens spektroszkópia alkalmazható a fehérjék egyensúlyi kibontakozásának jellemzésére azáltal, hogy denaturáló érték függvényében mérjük a fluoreszcencia -emisszió intenzitásának változását vagy a maximális emisszió hullámhosszát. A denaturálószer lehet kémiai molekula (karbamid, guanidinium -hidroklorid), hőmérséklet, pH, nyomás stb. A különböző, de diszkrét fehérjeállapotok, azaz a natív állapot, a köztes állapotok, a kihajtott állapot közötti egyensúly a denaturálószer értékétől függ; ezért egyensúlyi keverékük globális fluoreszcenciajele is ettől az értéktől függ. Így az ember olyan profilt kap, amely a globális fehérje jelet a denaturáló értékhez kapcsolja. Az egyensúly kibontakozásának profilja lehetővé teszi a kibontakozás közbenső termékeinek észlelését és azonosítását. Hugues Bedouelle általános egyenleteket dolgozott ki, hogy megkapja az ilyen profilokból azokat a termodinamikai paramétereket, amelyek a homomer vagy heteromer fehérjék kibontakozó egyensúlyát jellemzik, a trimerekig és potenciálisan tetramerekig. A fluoreszcens spektroszkópia kombinálható gyorskeveréses eszközökkel, például leállított áramlással , a fehérje hajtogatási kinetikájának mérésére, chevron-diagram létrehozására és Phi-érték elemzésére .
Körkörös dichroizmus
A cirkuláris dikroizmus az egyik legáltalánosabb és legalapvetőbb eszköz a fehérje hajtogatásának tanulmányozására. A cirkuláris dikroizmus spektroszkópia a körkörösen polarizált fény elnyelését méri . A fehérjékben az olyan struktúrák, mint az alfa -hélixek és a béta -lapok királisak, és így elnyelik az ilyen fényt. Ennek a fénynek az abszorpciója jelzi a fehérjeegyüttes hajtogatottságának mértékét. Ezt a technikát használták a fehérje egyensúlyi kibontakozásának mérésére az abszorpció változásának mérésével a denaturálószer koncentrációjának vagy hőmérsékletének függvényében . A denaturáló olvadék méri a kibontakozás szabad energiáját , valamint a fehérje m értékét vagy denaturáló függőségét. A hőmérsékleti olvadék a fehérje denaturációs hőmérsékletét (Tm) méri . Ami a fluoreszcens spektroszkópiát illeti, a cirkuláris dikroizmus spektroszkópia kombinálható gyorskeveréses eszközökkel, például leállított áramlással a fehérje hajtogatási kinetikájának mérésére és chevron-diagramok létrehozására .
A fehérjék vibrációs körkörös dikroizmusa
A fehérjékre vonatkozó vibrációs cirkuláris dikroizmus (VCD) technikák újabb fejlesztései , amelyek jelenleg Fourier -transzformációs (FT) műszereket foglalnak magukban , hatékony eszközöket biztosítanak a fehérjekonformációk meghatározására oldatban még nagyon nagy fehérjemolekulák esetében is. A fehérjék ilyen VCD vizsgálatai kombinálhatók a fehérjekristályok röntgendiffrakciós adataival, a nehézvizes (D 2 O) fehérjeoldatok FT-IR adataival vagy kvantumszámításokkal .
Fehérje nukleáris mágneses rezonancia spektroszkópia
A fehérje nukleáris mágneses rezonancia (NMR) képes fehérje szerkezeti adatait összegyűjteni mágneses mező indukálásával koncentrált fehérje mintákon keresztül. Az NMR-ben a kémiai környezettől függően bizonyos atommagok elnyelnek bizonyos rádiófrekvenciákat. Mivel a fehérje szerkezeti változásai n -től ms -ig terjedő időskálán működnek, az NMR különösen alkalmas a köztes struktúrák tanulmányozására a ps és s közötti időkeretben. Néhány a legfontosabb technikák tanulmányozására fehérjék szerkezetének és nem összecsukható fehérje strukturális változások közé tartozik a COSY , TOCSY , HSQC , időt relaxációs (T1 és T2), és a NOE . A NOE különösen hasznos, mert mágnesezési transzferek figyelhetők meg térben proximális hidrogének között. A különböző NMR -kísérletek különböző fokú érzékenységgel rendelkeznek, amelyek megfelelnek a különböző fehérjék szerkezeti változásainak. A NOE képes felvenni a kötés rezgéseit vagy az oldallánc -forgásokat, azonban a NOE túl érzékeny ahhoz, hogy felvegye a fehérje hajtogatását, mert nagyobb időtartamon belül fordul elő.
Mivel a fehérje hajtogatása körülbelül 50–3000 másodperc alatt megy végbe - 1 CPMG A relaxációs diszperzió és a kémiai csere -telítettség átvitele a hajtogatás NMR -elemzésének egyik elsődleges technikájává vált. Ezenkívül mindkét technikát használják a gerjesztett köztes állapotok feltárására a fehérje hajtogatási környezetében. Ehhez a CPMG Relaxation diszperzió kihasználja a spin echo jelenséget. Ez a technika a célmagot 90 impulzusnak teszi ki, amelyet egy vagy több 180 impulzus követ. Amint a magok újra összpontosítanak, a széles eloszlás azt jelzi, hogy a célmagok köztes gerjesztett állapotban vesznek részt. A relaxációs diszperziós diagramok megtekintésével az adatok információkat gyűjtenek a gerjesztett és a föld közötti termodinamikáról és kinetikáról. A telítettség -átvitel az alapállapotból származó jel változásait méri, amint a gerjesztett állapotok zavartak. Gyenge rádiófrekvenciás besugárzást alkalmaz egy adott atommag gerjesztett állapotának telítésére, amely telítettségét átviszi az alapállapotba. Ez a jel erősödik az alapállapot mágnesezettségének (és jelének) csökkentésével.
Az NMR fő korlátai, hogy a felbontása 25 kDa-nál nagyobb fehérjék esetén csökken, és nem olyan részletes, mint a röntgenkristályos vizsgálat . Ezenkívül a fehérje -NMR -elemzés meglehetősen nehéz, és több megoldást is javasolhat ugyanazon NMR -spektrumból.
Egy olyan vizsgálatban, amely az amyotrophic lateral sclerosis SOD1 fehérjét érintő hajtogatására összpontosított, az izgatott köztitermékeket relaxációs diszperzióval és telítettség -transzferrel tanulmányozták. A SOD1 korábban számos betegséget okozó mutánshoz volt kötve, amelyekről feltételezték, hogy részt vesznek a fehérjék aggregációjában, de a mechanizmus még mindig ismeretlen. Relaxációs diszperziós és telítettség -átviteli kísérletek alkalmazásával sok izgatott köztes állapotot fedeztek fel rosszul a SOD1 mutánsokban.
Kettős polarizációjú interferometria
A kettős polarizációjú interferometria egy felület-alapú technika a molekuláris rétegek optikai tulajdonságainak mérésére. A fehérje hajtogatásának jellemzésére a konformációt méri a fehérje egyrétegének teljes méretének és sűrűségének meghatározásával valós időben, Angstrom alatti felbontásban, bár a fehérje hajtogatásának kinetikájának valós idejű mérése csak azokra a folyamatokra korlátozódik, amelyek ~ 10 Hz -nél lassabban fordulnak elő. A körkörös dikroizmushoz hasonlóan a hajtogatás ingere lehet denaturálószer vagy hőmérséklet .
A hajtogatás tanulmányozása nagy időfelbontással
A fehérjehajtogatás vizsgálatát az elmúlt években nagymértékben előrelépte a gyors, időmegoldású technikák kifejlesztése. A kísérletezők gyorsan kiváltják a széthajtott fehérje minta összecsukását, és megfigyelik a kapott dinamikát . A használatban lévő gyors technikák közé tartozik a neutronszórás , az oldatok ultragyors keverése, a fotokémiai módszerek és a lézeres hőmérsékletugrás spektroszkópia . Ezen technikák kifejlesztésében közreműködő számos tudós között van Jeremy Cook, Heinrich Roder, Harry Gray , Martin Gruebele , Brian Dyer, William Eaton, Sheena Radford , Chris Dobson , Alan Fersht , Bengt Nölting és Lars Konermann.
Proteolízis
A proteolízist rutinszerűen használják a frakció szétválasztására az oldat széles körében (pl. Gyors párhuzamos proteolízis (FASTpp)) .
Egymolekulás erő spektroszkópia
Egymolekulás technikákat, például optikai csipeszeket és AFM -et alkalmaztak az izolált fehérjék, valamint a chaperonokkal rendelkező fehérjék hajtogatási mechanizmusainak megértéséhez. Optikai csipeszekkel egyetlen fehérje molekulát húztak le C- és N-végükről, és kibontották, hogy lehetővé tegyék a későbbi újrahajtogatás tanulmányozását. A technika lehetővé teszi a hajtogatási sebességek mérését egyetlen molekula szintjén; például a közelmúltban optikai csipeszt alkalmaztak a véralvadásban részt vevő fehérjék hajtogatásának és kibontásának tanulmányozására. A von Willebrand faktor (vWF) olyan fehérje, amely alapvető szerepet játszik a vérrögképződés folyamatában. Felismerte-egymolekulás optikai csipeszméréssel-, hogy a kalciumhoz kötött vWF nyíróerő-érzékelőként működik a vérben. A nyíróerő a vWF A2 doménjének kibontakozásához vezet, amelynek újrahajtogatási sebessége drámaian megnő a kalcium jelenlétében. A közelmúltban azt is kimutatták, hogy az egyszerű src SH3 tartomány erőszakkal több kibontási útvonalhoz fér hozzá.
Biotin festés
A biotin festés lehetővé teszi a (nem) hajtogatott fehérjék állapot-specifikus sejtes pillanatfelvételeit. A biotin „festménye” elfogultságot mutat a megjósolt, belső rendezetlen fehérjékkel szemben .
A fehérje hajtogatásának számítási tanulmányai
A fehérje hajtogatásának számítási tanulmányai három fő szempontot tartalmaznak, amelyek a fehérje stabilitásának, kinetikájának és szerkezetének előrejelzésével kapcsolatosak. Egy friss felülvizsgálat összefoglalja a fehérje hajtogatására rendelkezésre álló számítási módszereket.
Levinthal paradoxona
1969 -ben Cyrus Levinthal megjegyezte, hogy a kibontott polipeptidlánc nagyon sok szabadsági foka miatt a molekula csillagászati számú lehetséges konformációval rendelkezik. A becsült 3 300 , illetve 10 143 -ben készült egyik papírokat. Levinthal paradoxona egy gondolatkísérlet, amely azon a megfigyelésen alapul, hogy ha egy fehérjét minden lehetséges konformáció szekvenciális mintavételezésével hajtogatnak, akkor csillagászati időbe telik, még akkor is, ha a konformációk gyors mintavételezése történik ( nanoszekundumonként) vagy pikoszekundumos skála). Azon megfigyelés alapján, miszerint a fehérjék ennél sokkal gyorsabban hajlamosak, Levinthal ekkor azt javasolta, hogy véletlenszerű konformációs keresés ne forduljon elő, és ezért a fehérjének metastabil köztes állapotok sorozatán kell átmennie .
A fehérje hajtogatásának energetikai tája
A fehérje konfigurációs tere hajtogatás közben energetikai tájképként vizualizálható . Joseph Bryngelson és Peter Wolynes szerint a fehérjék a minimális frusztráció elvét követik, ami azt jelenti, hogy a természetben kifejlődött fehérjék optimalizálták a hajtogatási energiájukat, és a természet úgy választotta meg az aminosav -szekvenciákat, hogy a fehérje hajtogatott állapota kellően stabil legyen. Ezenkívül a hajtogatott állapot megszerzésének kellően gyors folyamatnak kellett lennie. Annak ellenére, hogy a természet csökkentette a fehérjékben tapasztalható frusztráció szintjét , bizonyos fokig ez a mai napig fennmarad, amint ez megfigyelhető a fehérjék energia -táján lokális minimumok jelenlétében.
Ezeknek az evolúciósan kiválasztott szekvenciáknak az a következménye, hogy a fehérjékről általában azt gondolják, hogy globálisan „körvonalas energia -tájképekkel ” rendelkeznek ( José Onuchic alkotta ), amelyek nagyrészt a natív állapotra irányulnak. Ez a " összecsukható tölcsér " táj lehetővé teszi, hogy a fehérje a számos útvonal és köztes termék bármelyikén keresztül a natív állapotba hajtsa, ahelyett, hogy egyetlen mechanizmusra korlátozódna. Az elméletet mind a modellfehérjék számítási szimulációi, mind a kísérleti tanulmányok alátámasztják , és a fehérjék szerkezetének előrejelzésére és tervezésére szolgáló módszerek javítására használták fel . A fehérje hajtogatásának leírása a kiegyenlítő szabadenergia-tájkép szerint szintén összhangban van a termodinamika 2. törvényével. Fizikailag talán kissé megtévesztő, ha a tájakat a vizualizálható potenciálra vagy a teljes energiafelületekre gondoljuk, egyszerűen a maximumokkal, nyeregpontokkal, minimumokkal és tölcsérrel. A vonatkozó leírás valójában egy nagy dimenziós fázistér, amelyben az elosztók különféle bonyolultabb topológiai formákat ölthetnek.
A széthajtott polipeptidlánc a tölcsér tetején kezdődik, ahol a legtöbb kihajtott variációt feltételezheti, és a legmagasabb energiaállapotban van. Az ilyen energetikai tájak azt jelzik, hogy sok a kezdeti lehetőség, de csak egyetlen őshonos állapot lehetséges; azonban nem tárja fel a lehetséges összecsukható utakat. Ugyanazon pontos fehérje különböző molekulája képes lehet arra, hogy kissé eltérő hajtogatási utakat kövessen, különböző alacsonyabb energiájú köztitermékeket keresve, mindaddig, amíg ugyanazt a természetes szerkezetet eléri. A különböző utak eltérő gyakoriságúak lehetnek, az egyes utak termodinamikai előnyétől függően. Ez azt jelenti, hogy ha az egyik utat termodinamikailag kedvezőbbnek találják, mint a másikat, akkor valószínűleg gyakrabban fogják használni a natív szerkezet keresésében. Ahogy a fehérje hajtogatni kezdi és felveszi különféle konformációit, mindig termodinamikailag kedvezőbb szerkezetet keres, mint korábban, és így folytatódik az energiatölcséren keresztül. A másodlagos struktúrák kialakulása erőteljesen jelzi a fehérje stabilitásának növekedését, és a polipeptid gerinc által feltételezett másodlagos szerkezetek csak egy kombinációjának lesz a legalacsonyabb energiája, és ezért jelen lesz a fehérje natív állapotában. Az első szerkezetek között, amelyek a polipeptid hajtogatásakor kialakulnak, az alfa -hélixek és a béta -fordulatok, ahol az alfa -hélixek akár 100 nanoszekundum alatt, a béta -fordulatok pedig 1 mikroszekundum alatt képződhetnek.
Van egy nyeregpont az energiatölcsér -tájban, ahol egy adott fehérje átmeneti állapota található. Az energiatölcsérdiagram átmeneti állapota az a konformáció, amelyet az adott fehérje minden molekulájának feltételeznie kell, ha a fehérje végre fel akarja venni a natív szerkezetet. Egyetlen fehérje sem vállalhatja a natív szerkezetet anélkül, hogy először átmenne az átmeneti állapoton. Az átmeneti állapotot a natív állapot változatának vagy idő előtti formájának nevezhetjük, nem pedig csak egy másik közvetítő lépésnek. Az átmeneti állapot hajtogatása sebességmeghatározónak bizonyult, és annak ellenére, hogy magasabb energiaállapotban létezik, mint a natív redő, nagyban hasonlít a natív szerkezetre. Az átmeneti állapoton belül létezik egy mag, amely körül a fehérje össze tud hajlani, amelyet egy "nukleációs kondenzációnak" nevezett folyamat képez, ahol a szerkezet elkezd a magra omlani.
A fehérje hajtogatásának modellezése
A számítási fehérjeszerkezet -előrejelzéshez de novo vagy ab initio technikák használhatók a fehérjehajtogatás különböző aspektusainak szimulálására. A molekuláris dinamikát (MD) alkalmazták a fehérje hajtogatásának és a silico dinamikájának szimulációjában. Az első egyensúlyi hajtogatási szimulációkat implicit oldószer modell és esernyő mintavétel segítségével végeztük. A számítási költségek miatt az ab initio MD hajtogatási szimulációk explicit vízzel csak peptidekre és nagyon kis fehérjékre korlátozódnak. A nagyobb fehérjék MD szimulációi a kísérleti szerkezet dinamikájára vagy annak magas hőmérsékletű kibontakozására korlátozódnak. Hosszú (körülbelül 1 milliszekundumon túli) hajtogatási folyamatok, mint például a kis méretű (kb. 50 maradék) vagy nagyobb hajtogatás, durva szemcsés modellekkel érhetők el.
Számos nagyszabású számítási projekt, például a Rosetta@home , a Folding@home és a Foldit célozza meg a fehérjehajtogatást.
Hosszú, folyamatos pályás szimulációkat végeztek Antonon , egy masszív párhuzamos szuperszámítógépen, amelyet a DE Shaw Research egyedi ASIC-k és összeköttetések köré tervezett és épített . Az Anton segítségével végzett szimuláció leghosszabb publikált eredménye az NTL9 2,936 milliszekundumos szimulációja 355 K -on.