Transzformáció (genetika) - Transformation (genetics)
A molekuláris biológia és a genetika , transzformáció a genetikai módosítása egy sejt eredő közvetlen felvétele és beépülése exogén genetikai anyag a környezetétől a sejtmembránon (ek). Ahhoz, hogy az átalakulás megtörténhessen, a befogadó baktériumnak kompetens állapotban kell lennie , ami előfordulhat a természetben, mint a környezeti feltételekre, például éhezésre és sejtsűrűségre adott, korlátozott válasz, és laboratóriumban is kiváltható.
A transzformáció a horizontális géntranszfer három folyamata egyike , amelyben az exogén genetikai anyag átmegy az egyik baktériumból a másikba, a másik kettő pedig a konjugáció ( genetikai anyag átvitele két közvetlen érintkezésben lévő baktériumsejt között) és a transzdukció (idegen DNS befecskendezése bakteriofág vírust a gazdabaktériumba). Az átalakulás során a genetikai anyag áthalad a közbeeső táptalajon, és a felvétel teljesen függ a befogadó baktériumtól.
2014-től körülbelül 80 baktériumfaj tudott átalakulni, körülbelül egyenletesen elosztva a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok között ; a szám túlbecsült lehet, mivel számos jelentést egyetlen dokumentum is alátámaszt.
A "transzformáció" kifejezés arra is használható, hogy leírja az új genetikai anyagnak a nem bakteriális sejtekbe történő beillesztését, beleértve az állati és növényi sejteket; azonban mivel az " átalakulás " különleges jelentéssel bír az állati sejtek vonatkozásában, ami rákos állapotba való progresszióra utal, a folyamatot általában " transzfekciónak " nevezik .
Történelem
A baktériumok átalakulását először 1928 -ban mutatta be Frederick Griffith brit bakteriológus . Griffith érdeklődött annak megállapítása iránt, hogy a hővel elölt baktériumok injekciói alkalmazhatók-e az egerek tüdőgyulladás elleni oltására. Ugyanakkor azt tapasztaltuk, hogy a nem virulens törzs Streptococcus pneumoniae lehetne tenni virulens miután találkozott a hővel elölt virulens törzsek. Griffith feltételezte, hogy az ártalmatlan törzs virulensé tételéért a hővel elpusztított törzs valamilyen " átalakító elve " felelős. 1944 -ben Oswald Avery , Colin MacLeod és Maclyn McCarty azonosította ezt az "átalakító elvet" genetikailag . A S. pneumoniae virulens törzséből izolálták a DNS -t, és csak ezt a DNS -t használva képesek voltak ártalmatlan törzset virulenssé tenni. Ezt a DNS baktériumok általi felvételét és beépítését "transzformációnak" nevezték (Lásd Avery-MacLeod-McCarty kísérlet ) Avery és társai kísérleteinek eredményeit a szkeptikusok eleinte szkeptikusan fogadták, és csak a genetikai fejlődés után marker és a genetikai transzfer egyéb módszereinek felfedezése ( konjugáció 1947 -ben és transzdukció 1953 -ban) Joshua Lederberg szerint Avery kísérleteit elfogadták.
Eredetileg azt hitték, hogy az Escherichia coli , egy általánosan használt laboratóriumi szervezet, nem képes átalakulni. 1970 -ben azonban Morton Mandel és Akiko Higa kimutatták, hogy az E. coli -t a kalcium -klorid -oldattal végzett kezelés után segítő fág használata nélkül is elő lehet idézni, hogy DNS -t vegyen fel a λ bakteriofágból . Két évvel később, 1972 -ben Stanley Norman Cohen , Annie Chang és Leslie Hsu kimutatták, hogy a CaCl
2A kezelés hatékony a plazmid DNS transzformációjában is. A Mandel és Higa átalakítási módszerét később Douglas Hanahan továbbfejlesztette . Az E. coli mesterségesen előidézett kompetenciájának felfedezése hatékony és kényelmes eljárást hozott létre a baktériumok transzformálására, amely egyszerűbb molekuláris klónozási módszereket tesz lehetővé a biotechnológiában és a kutatásban , és ma már rutinszerűen alkalmazott laboratóriumi eljárás.
Az elektroporációt alkalmazó transzformációt az 1980-as évek végén fejlesztették ki, növelve az in vitro transzformáció hatékonyságát és növelve az átalakítható baktériumtörzsek számát . Az állati és növényi sejtek transzformációját is vizsgálták. Az első transzgénikus egeret 1982 -ben egy patkány növekedési hormonjának génjének egér embrióba történő befecskendezésével hozták létre. 1897 -ben felfedezték a növényi daganatokat okozó baktériumot, az Agrobacterium tumefaciens -t. 1970-es évek a tumor-indukáló szer találtuk, hogy egy DNS- plazmid az úgynevezett Ti plazmid . A daganatot okozó plazmid génjeinek eltávolításával és új gének hozzáadásával a kutatók képesek voltak megfertőzni a növényeket A. tumefaciens -el, és hagyni, hogy a baktériumok beilleszthessék a kiválasztott DNS -t a növények genomjaiba. Nem minden növényi sejt érzékeny az A. tumefaciens fertőzésre , ezért más módszereket fejlesztettek ki, beleértve az elektroporációt és a mikroinjekciót . A részecskék bombázását John Sanford feltalálta a Biolistic Particle Delivery System ( génfegyver) feltalálásával az 1980 -as években.
Definíciók
A transzformáció a természetben a baktériumok között előforduló vízszintes géntranszfer három formájának egyike, amelyben egy tulajdonságot kódoló DNS átmegy egyik baktériumból a másikba, és homológ rekombinációval integrálódik a recipiens genomba ; a másik kettő a transzdukció , amelyet bakteriofág segítségével hajtanak végre , és a konjugáció , amelyben egy gént baktériumok közötti közvetlen érintkezés útján továbbítanak. Az átalakulás során a genetikai anyag áthalad a közbeeső táptalajon, és a felvétel teljesen függ a befogadó baktériumtól.
A kompetencia arra az átmeneti állapotra utal, amikor képes exogén DNS -t felvenni a környezetből; laboratóriumban indukálható.
Úgy tűnik, hogy ez egy ősi folyamat, amelyet egy közös prokarióta őstől örököltek, és amely hasznos adaptáció a DNS -károsodások rekombinációs javításának előmozdításához, különösen a stresszes körülmények között szerzett károkhoz. A természetes genetikai transzformáció a DNS -károsodások helyreállításához való alkalmazkodásnak tűnik, amely genetikai sokféleséget is generál .
Az átalakulást orvosilag fontos Gram-negatív baktériumfajokban , például Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae és Vibrio cholerae vizsgálták . Azt is vizsgálták a Gram-negatív fajok a talajban, mint a Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , és Gram-negatív növényi kórokozók , mint például a Ralstonia solanacearum és Xylella fastidiosa . A Gram-pozitív baktériumok közötti transzformációt orvosilag fontos fajokban, például Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus és Streptococcus sanguinis, valamint Gram-pozitív talajbaktériumban, a Bacillus subtilis-ben vizsgálták . Legalább 30 alfa-, béta-, gamma- és epsilon -osztályba sorolt proteobaktérium -fajról is beszámoltak . A transzformáció szempontjából a legjobban tanulmányozott proteobaktériumok az orvosilag fontos emberi kórokozók: Neisseria gonorrhoeae (béta osztály), Haemophilus influenzae (gamma osztály) és Helicobacter pylori (epsilon osztály)
A "transzformáció" kifejezés arra is használható, hogy leírja az új genetikai anyagnak a nem bakteriális sejtekbe történő beillesztését, beleértve az állati és növényi sejteket; azonban mivel az " átalakulás " különleges jelentéssel bír az állati sejtek vonatkozásában, ami rákos állapotba való progresszióra utal, a folyamatot általában " transzfekciónak " nevezik .
Természetes kompetencia és átalakulás
2014-től körülbelül 80 baktériumfaj tudott átalakulni, körülbelül egyenletesen elosztva a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok között ; a szám túlbecsült lehet, mivel számos jelentést egyetlen dokumentum is alátámaszt.
A természetben kompetens baktériumok olyan génkészleteket hordoznak, amelyek biztosítják a fehérje gépezetét a DNS átviteléhez a sejtmembrán (ok) on. Az exogén DNS sejtekbe történő szállításához olyan fehérjékre lehet szükség, amelyek részt vesznek a IV -es típusú pili és a II -es típusú szekréciós rendszer összeállításában , valamint DNS -transzlokáz komplexet a citoplazmatikus membránon.
A Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok közötti sejtburok szerkezetének különbségei miatt bizonyos különbségek vannak ezekben a sejtekben a DNS-felvétel mechanizmusai között, azonban legtöbbjüknek vannak közös vonásai, amelyek rokon fehérjéket tartalmaznak. A DNS először egy DNS -receptoron kötődik az illetékes sejtek felületéhez, és DNS -transzlokázon keresztül áthalad a citoplazmatikus membránon . Csak egyszálú DNS haladhat át, a másik szálat a folyamat során nukleázok bontják le. A transzlokált egyszálú DNS ezután RecA -függő eljárással integrálható a bakteriális kromoszómákba . Gram-negatív sejtekben egy extra membrán jelenléte miatt a DNS megköveteli a külső membránon szekrétek által képzett csatorna jelenlétét. Pilintre szükség lehet a kompetenciához, de szerepe bizonytalan. A DNS felvétele általában nem szekvencia-specifikus, bár egyes fajoknál a specifikus DNS-felvételi szekvenciák jelenléte megkönnyítheti a hatékony DNS-felvételt.
Természetes átalakulás
A természetes transzformáció egy bakteriális adaptáció a DNS -átvitelhez, amely számos bakteriális gén expressziójától függ, amelyek termékei felelősek ezért a folyamatért. Általában az átalakítás összetett, energiát igénylő fejlesztési folyamat. Ahhoz, hogy egy baktérium megköthesse, felvegye és rekombinálja az exogén DNS -t a kromoszómájába, kompetenssé kell válnia, vagyis különleges élettani állapotba kell lépnie. A Bacillus subtilis kompetenciafejlesztése körülbelül 40 gén expresszióját igényli. A gazdaszervezet kromoszómájába integrált DNS általában (de ritka kivételektől eltekintve) ugyanazon faj másik baktériumából származik, és így homológ a rezidens kromoszómával.
A B. subtilis esetében az átvitt DNS hossza nagyobb, mint 1271 kb (több mint 1 millió bázis). Az átvitt hossz valószínűleg kettős szálú DNS, és gyakran több mint a harmada a 4215 kb -os teljes kromoszómahossznak. Úgy tűnik, hogy a recipiens sejtek körülbelül 7-9% -a elfoglal egy teljes kromoszómát.
Úgy tűnik, hogy a természetes átalakulás képessége számos prokariótában előfordul, és eddig 67 prokarióta faj (hét különböző fajban) ismert ezen a folyamaton.
A transzformációs kompetenciát jellemzően a magas sejtsűrűség és/vagy a táplálkozási korlátozások okozzák, amelyek a baktériumok szaporodásának stacionárius fázisához kötődnek. A Haemophilus influenzae transzformációja a leghatékonyabban az exponenciális növekedés végén következik be, amikor a baktériumok szaporodása az állófázishoz közeledik. A transzformáció a Streptococcus mutans -ban, valamint sok más streptococcusban is nagy sejtsűrűség mellett megy végbe, és biofilm képződéssel jár. A kompetenciát a B. subtilis -ben a logaritmikus növekedés vége felé indukáljuk, különösen aminosavkorlátozás körülményei között. Hasonlóképpen, a Micrococcus luteus (a kevésbé jól tanulmányozott Actinobacteria phylum képviselője) esetében a kompetencia a közép-késői exponenciális növekedési szakaszban fejlődik, és az aminosavak éhezése is kiváltja.
Az ép gazdaszervezet és a plazmid DNS felszabadításával bizonyos bakteriofágokról feltételezik, hogy hozzájárulnak az átalakuláshoz.
Transzformáció, mint adaptáció a DNS -javításhoz
A kompetenciát kifejezetten a DNS -károsító körülmények váltják ki. Például a transzformációt Streptococcus pneumoniae- ben a DNS-károsító szerek, a mitomicin C (egy DNS-térhálósító szer) és a fluorokinolon (topoizomeráz-inhibitor, amely kettős szálú törést okoz) indukálják . A B. subtilis esetében a transzformációt fokozza az UV -fény, egy DNS -károsító szer. A Helicobacter pylori- ban a ciprofloxacin, amely kölcsönhatásba lép a DNS-girázzal és kettős szálú töréseket vezet be, a kompetenciagének kifejeződését indukálja, ezáltal fokozza az átalakulás gyakoriságát Legionella pneumophila alkalmazásával Charpentier et al. 64 mérgező molekulát tesztelt annak megállapítására, hogy ezek közül melyik indukálja a kompetenciát. Ebből csak hat, minden DNS -károsító szer okozott erős indukciót. Ezek a DNS-károsító szerek a következők voltak: mitomicin C (ami DNS-szálak közötti keresztkötéseket okoz), norfloxacin, ofloxacin és nalidixisav (a DNS-giráz gátlói, amelyek kettős szálú törést okoznak), biciklomicin (egy- és kétszálú törést okoz) és hidroxi-karbamid (DNS -bázis oxidációt indukál). Az UV -fény kompetenciát is indukált az L. pneumophila -ban . Charpentier és mtsai. azt javasolta, hogy az átalakításra való kompetencia valószínűleg DNS -károsodási válaszként fejlődött ki.
A logaritmikusan növekvő baktériumok a sejtben lévő genompéldányok számában különböznek az állófázisú baktériumoktól, és ez kihatással van egy fontos DNS -javítási folyamat végrehajtására. A logaritmikus növekedés során a kromoszóma bármely régiójának két vagy több másolata jelen lehet egy baktériumsejtben, mivel a sejtosztódás nem egyezik pontosan a kromoszóma replikációjával. A homológ rekombinációs javítás (HRR) folyamata kulcsfontosságú DNS-javítási folyamat, amely különösen hatékony a kétszálú sérülések, például a kétszálú törések helyreállításában. Ez a folyamat a sérült kromoszóma mellett egy második homológ kromoszómától is függ. A logaritmikus növekedés során az egyik kromoszóma DNS -károsodását a HRR javíthatja a másik homológ kromoszóma szekvencia -információinak felhasználásával. Amint a sejtek megközelítik az állófázist, általában csak egy példányuk van a kromoszómából, és a HRR megköveteli a homológ templát bevitelét a sejten kívülről transzformációval.
Annak tesztelésére, hogy a transzformáció adaptív funkciója a DNS -károsodások helyreállítása, egy kísérletsorozatot végeztek -e károsító ágenssel, B. subtilis alkalmazásával, amelyet UV -fény sugárzott (Michod és mtsai. És Bernstein és mtsai.) kísérletek azt mutatták, hogy a transzformáló DNS javítja a potenciálisan halálos DNS -károsodásokat, amelyeket az UV -fény okoz a befogadó DNS -ben. A javításért felelős folyamat valószínűleg a HRR volt. A baktériumokban történő transzformáció primitív szexuális folyamatnak tekinthető, mivel két személy homológ DNS -jének kölcsönhatását foglalja magában, hogy rekombináns DNS -t képezzen, amelyet továbbadnak a következő generációknak. A prokariótákban a baktériumok átalakulása lehetett az ősi folyamat, amely meiotikus szexuális szaporodást eredményezett az eukariótákban (lásd: A szexuális szaporodás evolúciója ; Meiózis) .
Az átalakítás módszerei és mechanizmusai a laboratóriumban
Bakteriális
Mesterséges kompetencia indukálható olyan laboratóriumi eljárásokban, amelyek magukban foglalják a sejt passzív áteresztését a DNS számára, ha olyan körülményeknek teszik ki, amelyek általában nem fordulnak elő a természetben. A sejteket jellemzően kétértékű kationokat (gyakran kalcium -kloridot ) tartalmazó oldatban inkubálják hideg körülmények között, mielőtt hőimpulzusnak (hősokknak) tennék ki. A kalcium -klorid részben megzavarja a sejtmembránt, ami lehetővé teszi a rekombináns DNS bejutását a gazdasejtbe. Azokat a sejteket, amelyek képesek felvenni a DNS -t, kompetens sejteknek nevezzük.
Azt találták, hogy a Gram-negatív baktériumok növekedése 20 mM Mg-ban csökkenti a fehérje- lipopoliszacharid kötések számát azáltal, hogy növeli az ionos és kovalens kötések arányát, ami növeli a membrán folyékonyságát, megkönnyítve az átalakulást. A lipopoliszacharidok szerepe itt azt a megfigyelést igazolja, hogy a rövidebb O-oldalláncok hatékonyabban transzformálódnak-talán a javított DNS-hozzáférhetőség miatt.
A baktériumok, például az E. coli felülete negatív töltésű a sejtfelületén lévő foszfolipidek és lipopoliszacharidok miatt , és a DNS is negatív töltésű. A kétértékű kation egyik funkciója ezért a töltések védelme a foszfátcsoportok és más negatív töltések összehangolásával, ezáltal lehetővé téve egy DNS -molekula tapadását a sejtfelszínhez.
Az E. coli sejtekbe történő DNS -bejutás az adhéziós zónák vagy Bayer -csomópontok néven ismert csatornákon keresztül történik, és egy tipikus sejt 400 ilyen zónát hordoz. Szerepüket akkor állapították meg, amikor a kobalaminról (amely szintén ezeket a csatornákat használja) megállapították, hogy versenyképesen gátolja a DNS -felvételt. Egy másik típusú csatorna, amely részt vesz a DNS felvételében, poli (HB): poli P: Ca. Ebben a poli (HB) elképzelhető, hogy körülveszi a DNS -t (maga polifoszfát), és Ca -ionokból álló pajzsban hordják.
Javasolt, hogy a sejtek hideg állapotban történő kétértékű kationoknak való kitettsége is megváltoztathatja vagy gyengítheti a sejtfelszíni szerkezetet, így jobban átjárhatóvá válik a DNS számára. Úgy gondolják, hogy a hőimpulzus termikus egyensúlyhiányt okoz a sejtmembránon, ami arra kényszeríti a DNS-t, hogy vagy a sejtpórusokon vagy a sérült sejtfalon keresztül belépjen a sejtekbe.
Az elektroporáció egy másik módszer a kompetencia előmozdítására. Ennél a módszernél a sejteket 10-20 kV /cm-es elektromos mezővel rövid ideig sokkolják , amelyről azt gondolják, hogy lyukakat hoznak létre a sejtmembránon, amelyen keresztül a plazmid DNS bejuthat. Az áramütés után a lyukakat gyorsan lezárják a cella membránjavító mechanizmusai.
Élesztő
A legtöbb élesztőfajta , beleértve a Saccharomyces cerevisiae -t , a környezetben lévő exogén DNS -sel átalakítható. Számos módszert fejlesztettek ki ennek az átalakításnak a nagy gyakorisággal történő elősegítésére a laborban.
- Az élesztősejteket enzimekkel lehet kezelni, hogy lebontják sejtfalukat, és szferoplasztokat kapnak . Ezek a sejtek nagyon törékenyek, de nagy sebességgel vesznek fel idegen DNS -t.
- Az ép élesztősejtek lúgos kationokkal , például céziummal vagy lítiummal való érintkezése lehetővé teszi a sejtek számára, hogy felvegyék a plazmid DNS -t . A későbbi protokollok ezt az átalakítási módszert adaptálták, lítium-acetátot , polietilénglikolt és egyszálú DNS-t használva . Ezekben a protokollokban az egyszálú DNS előnyösen az élesztő sejtfalához kötődik, megakadályozva ezzel a plazmid DNS-t, és hagyja azt transzformációra.
- Elektroporáció : Átmeneti lyukak képződése a sejtmembránokban áramütés segítségével; ez lehetővé teszi a DNS bejutását a fent leírtak szerint a baktériumok esetében.
- Az élesztősejtek átalakítására enzimes emésztést vagy üveggyöngyökkel történő keverést is alkalmazhatunk.
Hatékonyság - A különböző élesztő nemzetségek és fajok különböző hatékonysággal veszik fel az idegen DNS -t. Továbbá, a legtöbb transzformációs protokoll a pékélesztő, S. cerevisiae számára lett kifejlesztve , és így nem biztos, hogy optimális más fajok számára. Még egy fajon belül is a különböző törzsek eltérő transzformációs hatékonysággal rendelkeznek, néha három nagyságrenddel eltérőek. Például, amikor az S. cerevisiae törzseket 10 ug YEp13 plazmiddal transzformáltuk, a DKD-5D-H törzs 550 és 3115 kolóniát eredményezett, míg az OS1 törzs kevesebb, mint öt telepet.
Növények
Számos módszer áll rendelkezésre a DNS növényi sejtekbe történő átvitelére. Néhány vektor által közvetített módszer:
- Az Agrobacterium által közvetített transzformáció a legegyszerűbb és legegyszerűbb növénytranszformáció. A növényi szöveteket (gyakran leveleket) apró darabokra vágjuk, pl. 10x10 mm -re, és tíz percig áztatjuk egy szuszpendált Agrobacteriumot tartalmazó folyadékban. A baktériumok sok vágás által kitett növényi sejthez kötődnek. A növényi sejtek sebekkel kapcsolatos fenolvegyületeket választanak ki, amelyek viszont az Agrobacterium virulencia-operonját szabályozzák. A virulencia operon számos gént tartalmaz, amelyek olyan fehérjéket kódolnak, amelyek a IV. Típusú szekréciós rendszer részét képezik, és amelyek a baktériumfehérjékből és a DNS -ből exportálnak (meghatározott felismerési motívumok határozzák meg, amelyeket határszekvenciáknak neveznek, és egyetlen szálként kivágnak a virulencia -plazmidból) a növénybe sejt egy pilus nevű szerkezeten keresztül. Az átvitt DNS-t (az úgynevezett T-DNS-t) az Agrobacterium VirD2 fehérjében található nukleáris lokalizációs jelekkel kísérlik a növényi sejtmagba, amely kovalensen kapcsolódik a T-DNS végéhez a jobb oldalon (RB). A T-DNS pontos integrációja a gazdanövény genomiális DNS-ébe a növénybiológiai kutatások aktív területe. Feltételezve, hogy egy szelekciós marker (például egy antibiotikum-rezisztencia gén) szerepelt a T-DNS-ben, a transzformált növényi szövetet szelektív táptalajon tenyészthetjük hajtások előállítása céljából. A hajtásokat ezután más táptalajra helyezzük, hogy elősegítsük a gyökérzet kialakulását. Amint a gyökerek növekedni kezdenek a transzgénikus hajtásból, a növényeket át lehet vinni a talajba a normális életciklus befejezése érdekében (magokat kell készíteni). Ennek az első növénynek (az első transzgenikus generációnak nevezett T1) magjait szelektívre (antibiotikumot tartalmazó) lehet ültetni, vagy ha herbicidrezisztencia gént használtak, akkor alternatív módon a talajba is ültethetők, majd később herbiciddel kezelhetők. ölje meg a vad típusú szegregátumokat. Néhány növényfaj, például az Arabidopsis thaliana a virágok vagy az egész növény mártásával átalakítható Agrobacterium tumefaciens szuszpenziójává, jellemzően a C58 törzsbe (C = Cseresznye, 58 = 1958, az év, amikor az A. tumefaciens ezen törzsevolt a New York -i Ithaca -i Cornell Egyetem gyümölcsösében található cseresznyefától). Bár sok növény továbbra sem hajlandó az átalakításra ezzel a módszerrel, folyamatban van a kutatás, amely továbbra is hozzáadja a listához az ilyen módon sikeresen módosított fajokat.
- Vírusos transzformáció ( transzdukció ): Csomagolja be a kívánt genetikai anyagot megfelelő növényi vírusba, és hagyja, hogy ez a módosított vírus megfertőzze a növényt. Ha a genetikai anyag DNS, akkor rekombinálódhat a kromoszómákkal, és transzformáns sejteket termelhet. A legtöbb növényi vírus genomja azonban egyszálú RNS -ből áll, amely a fertőzött sejt citoplazmájában replikálódik. Az ilyen genomok esetében ez a módszer a transzfekció egyik formája, és nem valódi átalakulás, mivel a beillesztett gének soha nem érik el a sejt magját, és nem integrálódnak a gazdaszervezet genomjába. A fertőzött növények utódai vírusmentesek, és a beépített géntől is mentesek.
Néhány vektor nélküli módszer:
- Génpisztoly : részecskebombázásnak, mikroprojektív bombázásnak vagy biolisztikának is nevezik. Az arany vagy wolfram részecskéket DNS -sel bevonják, majd fiatal növényi sejtekbe vagy növényi embriókba lövik. Néhány genetikai anyag a sejtekben marad és átalakítja azokat. Ez a módszer lehetővé teszi a növényi plasztidok átalakítását is. A transzformációs hatékonyság alacsonyabb, mint az Agrobacterium által közvetített transzformációban, de a legtöbb növény transzformálható ezzel a módszerrel.
- Elektroporáció : Átmeneti lyukak képződése a sejtmembránokban nagy térerősségű elektromos impulzusok segítségével; ez lehetővé teszi a DNS bejutását a fent leírtak szerint a baktériumok esetében.
Gombák
Vannak módszerek transzgénikus gombák előállítására, amelyek többsége analóg a növényeknél alkalmazott módszerekkel. A gombákat azonban másképpen kell kezelni, mikroszkopikus és biokémiai tulajdonságaik miatt:
- Nagy probléma az a dikarióta állapot , amelyben egyes gombák bizonyos részei vannak; A dikarióta sejtek két haploid magot tartalmaznak, mindegyik szülő gomba egyikét. Ha ezek közül csak az egyik transzformálódik, ami a szabály, akkor a transzformált magok százalékos aránya minden sporuláció után csökken .
- A gombás sejtfalak meglehetősen vastagok, akadályozzák a DNS felvételét, ezért gyakran (részleges) eltávolításra van szükség; a teljes lebomlás, ami néha szükséges, protoplasztokat eredményez .
- A micélium gombák fonalas hifákból állnak , amelyeket - ha egyáltalán egyáltalán - belső sejtfalak választanak el egymástól, amelyek elég nagy pórusokkal vannak megszakítva, hogy a tápanyagok és az organellák, néha magok is átjárhassák az egyes hifákat. Ennek eredményeként az egyes sejteket általában nem lehet szétválasztani. Ez problémás, mivel a szomszédos transzformált sejtek a transzformálatlan sejteket immunissá tehetik a szelekciós kezelésekkel szemben, például tápanyagok vagy fehérjék bejuttatásával az antibiotikum -rezisztenciához.
- Ezenkívül ezeknek a gombáknak a növekedése (és ezáltal a mitózis) kizárólag a hifák csúcsán fordul elő, ami szintén problémákat okozhat.
Amint azt korábban említettük, a növények átalakítására használt módszerek sora a gombákban is működik:
- Az Agrobacterium nemcsak növényeket, hanem gombákat is képes megfertőzni, azonban a növényekkel ellentétben a gombák nem választják ki az Agrobacterium kiváltásához szükséges fenolos vegyületeket, így azokat hozzáadni kell, például acetosziringon formájában .
- A gombákban lévő kis RNS-ek expressziós rendszerének kifejlesztésének köszönhetően lehetővé vált a CRISPR/CAS9 rendszer bevezetése a gombasejtekbe. 2016-ban az USDA kijelentette, hogy nem szabályozza a CRISPR/CAS9-gyel szerkesztett fehér gombás törzset, hogy megakadályozza a gyümölcs testének barnulását, ami széles körű vitát vált ki a CRISPR/CAS9 által szerkesztett növények forgalomba hozataláról.
- A gombákra alkalmazhatók olyan fizikai módszerek is, mint az elektroporáció, a biolisztika („ génpisztoly ”), az ultrahanggal keletkező gázbuborékok kavitációját alkalmazó szonoporáció , stb.
Állatok
A DNS állati sejtekbe történő bevitelét általában transzfekciónak nevezik , és a megfelelő cikk tárgyalja.
Az átalakulás gyakorlati vonatkozásai a molekuláris biológiában
A baktériumok mesterségesen előidézett kompetenciájának felfedezése lehetővé teszi az olyan baktériumok, mint az Escherichia coli , kényelmes gazdaszervezetként történő felhasználását a DNS manipulálásához és a fehérjék expresszálásához. Tipikusan plazmidokat használnak az E. coli -ban történő transzformációhoz . Annak érdekében, hogy a plazmid stabilan fennmaradjon a sejtben, a plazmid DNS -molekulának tartalmaznia kell a replikáció origóját , amely lehetővé teszi, hogy replikálódjon a sejtben, függetlenül a sejt saját kromoszómájának replikációjától.
Azt a hatékonyságot, amellyel egy kompetens tenyészet képes felvenni exogén DNS -t, és kifejezni génjeit, transzformációs hatékonyságnak nevezik, és telep -képző egységben (cfu) mérik a felhasznált μg DNS -enként. A transzformációs hatékonyság 1 × 10 8 cfu / ug egy kis plazmid, mint pUC19 nagyjából egyenértékű 1 2000-molekulák használt plazmid a transzformált.
A kalcium -klorid transzformáció során a sejteket úgy készítik el, hogy a sejteket Ca jelenlétében lehűtik2+
(a CaCl -ban
2oldat), így a sejt permeábilissá válik a plazmid DNS számára . A sejteket jégen inkubáljuk a DNS-sel, majd rövid ideig hősokkban (pl. 42 ° C-on 30–120 másodpercig). Ez a módszer nagyon jól működik a cirkuláris plazmid DNS esetében. Nem kereskedelmi készítmények általában így 10 6 , hogy 10 7 transzformált sejtet mikrogramm plazmidot; a gyenge készítmény körülbelül 10 4 /μg vagy kevesebb lesz, de a kompetens sejtek jó előkészítése akár ~ 10 8 telepet is adhat mikrogramm plazmidonként. Léteznek azonban protokollok szuperkompetens sejtek előállítására, amelyek 10 9 feletti transzformációs hatékonyságot eredményezhetnek . A kémiai módszer azonban általában nem működik jól a lineáris DNS -hez, például a kromoszóma -DNS -töredékekhez, valószínűleg azért, mert a sejt natív exonukleáz enzimjei gyorsan lebontják a lineáris DNS -t . Ezzel szemben a természetben kompetens sejtek általában hatékonyabban transzformálódnak lineáris DNS -sel, mint plazmid DNS -sel.
Az átalakítás hatékonysága a CaCl használatával
2módszer csökken a plazmid méretével, és ezért az elektroporáció hatékonyabb módszer lehet a nagy plazmid DNS felvételére. Az elektroporációhoz használt sejteket először hideg, kétszer desztillált vízben történő mosással kell előkészíteni, hogy eltávolítsuk a töltött részecskéket, amelyek szikrákat okozhatnak az elektroporációs folyamat során.
Kiválasztás és szűrés a plazmid transzformációban
Mivel a transzformáció rendszerint viszonylag kevés transzformált sejt és rengeteg nem transzformált sejt keverékét eredményezi, módszert kell alkalmazni a plazmidot megszerző sejtek kiválasztására. A plazmidnak ezért olyan szelektálható markerre van szüksége , hogy a plazmid nélküli sejtek elpusztulhassanak, vagy a növekedésük leálljon. Az antibiotikum -rezisztencia a prokarióták leggyakrabban használt markere. A transzformáló plazmid olyan gént tartalmaz, amely rezisztenciát biztosít az antibiotikumokkal szemben, amelyekre a baktériumok egyébként érzékenyek. A kezelt sejtek keverékét az antibiotikumot tartalmazó táptalajon tenyésztjük, így csak a transzformált sejtek képesek növekedni. Egy másik kiválasztási módszer bizonyos auxotróf markerek alkalmazása, amelyek kompenzálják bizonyos aminosavak, nukleotidok vagy cukrok metabolizálásának képtelenségét. Ez a módszer megfelelő mutációjú törzsek használatát igényli, amelyek hiányosak egy adott biomolekula szintézisében vagy hasznosságában, és a transzformált sejteket olyan tápközegben tenyésztik, amely csak a plazmidot tartalmazó sejtek növekedését teszi lehetővé.
Egy klónozási kísérletben egy gént lehet beépíteni a transzformációhoz használt plazmidba. Egy ilyen kísérletben azonban nem minden plazmid tartalmazhat sikeresen beillesztett gént. Ezért további technikákat lehet alkalmazni a plazmidot tartalmazó transzformált sejtek szkrínelésére az inszertummal. Riportergének használhatók markerként , például a lacZ gén, amely a kék-fehér szűrés során használt β-galaktozidázt kódolja . Ez a szűrési módszer az α- komplementáció elvére támaszkodik , ahol a lacZ gén ( lacZα ) fragmense a plazmidban kiegészítheti a sejt másik lacZ génjét ( lacZΔM15 ). Mindkét gén önmagában nem funkcionális peptideket termel, azonban együtt expresszálva, például amikor a lacZ-a- t tartalmazó plazmidot lacZAM15 sejtekké alakítják át , funkcionális β-galaktozidázt képeznek. Aktív β-galaktozidáz jelenléte kimutatható, ha a sejteket X-gal tartalmazó lemezeken tenyésztik , és jellegzetes kék telepeket képeznek. Azonban a többszörös klónozó hely , ahol a kívánt gén ligálható a plazmid vektorba , a lacZa génen belül található . A sikeres ligálás ezért megszakítja a lacZα gént, és nem tud működőképes β-galaktozidáz képződni , ami fehér telepeket eredményez. A sikeresen ligált betétet tartalmazó sejteket ezután könnyen fel lehet ismerni fehér színük alapján a sikertelen kékből.
További gyakran használt riportergének a zöld fluoreszcens fehérje (GFP), amely kék fényben zölden világít, és a luciferáz enzim , amely katalizálja a luciferinnel történő fénykibocsátást. A rekombináns DNS más módszerekkel is kimutatható, például radioaktív RNS -próbával végzett nukleinsav -hibridizációval, míg a kívánt fehérjét a plazmidból expresszáló sejtek immunológiai módszerekkel is kimutathatók.
Hivatkozások
Külső linkek
- Bakteriális transzformáció (flash animáció)
- - Kész, célozz, lőj! A potsdami Max Planck Molekuláris Növényélettani Intézetben részecskepisztoly segítségével „bombázzák” a növényi sejteket