Respirometria - Respirometry
Respirometriás egy általános kifejezés, amely magában foglalja számos technikát megszerzésére becslések mértékének metabolizmus a gerincesek , gerinctelenek , növények , szövetek, sejtek, vagy mikroorganizmusok keresztül indirekt mérésére hőtermelés ( kalorimetria ).
Az egész állat anyagcseréje
Az állat anyagcseréjét úgy becsüljük meg, hogy meghatározzuk az egyes állatok széndioxid- termelésének (VCO 2 ) és oxigénfogyasztásának (VO 2 ) arányát , akár zárt, akár nyitott körű légzésmérő rendszerben. Jellemzően két mérést kapunk: standard (SMR) vagy bazális anyagcsere sebesség (BMR) és maximális sebesség ( VO2max ). Az SMR-t akkor mérik, amikor az állat nyugalomban van (de nem alszik) meghatározott laboratóriumban (hőmérséklet, hidratálás) és alanyspecifikus körülmények között (pl. Méret vagy allometria ), korban, reprodukciós állapotban, utóabszorpciós hatással, hogy elkerüljék az étel hőhatását ). . A VO 2 max értéket tipikusan az aerob testmozgás során határozzák meg fiziológiai határok közelében vagy annak közelében. Ezzel szemben a terepi anyagcsere sebesség (FMR) egy korlátlan, aktív természetű anyag metabolikus sebességére utal. A teljes állatállomány anyagcseréje ezekre az intézkedésekre vonatkozik, a testtömeg korrekciója nélkül. Ha az SMR vagy BMR értékeket elosztjuk az állat testtömeg értékével, akkor a sebességet tömegspecifikusnak nevezzük. A fajok közötti összehasonlításban általában ezt a tömegspecifikus értéket hallja az ember.
Zárt légzésmérés
A respirometria a "mi megy be, annak ki kell jönnie" elvtől függ. Fontolja meg először a zárt rendszert. Képzelje el, hogy az egeret egy légmentesen lezárt edénybe helyezzük. A tartályban lezárt levegő kezdetben ugyanolyan összetételű és arányú gázokat tartalmaz, mint a szobában: 20,95% O 2 , 0,04% CO 2 , vízgőz (a pontos mennyiség a levegő hőmérsékletétől függ, lásd a harmatpontot ), 78% (hozzávetőlegesen) N 2 , 0,93% argon és különféle nyomgázok alkotják a többit (lásd a Föld légkörét ). Az idő múlásával a kamrában lévő egér CO 2 -ot és vízgőzt termel , de anyagcsereszükségletével arányosan kivonja az O 2 -et a levegőből. Ezért, amíg ismerjük a rendszer térfogatát, a különbség az O 2 és a CO 2 koncentrációja között az induláskor, amikor az egeret bezártuk a kamrába (az alapvonal vagy a referenciafeltételek) az egér után jelenlévő mennyiségekhez képest később levegőt kapott, meg kell felelnie az egér által termelt / elfogyasztott CO 2 / O 2 mennyiségnek . A nitrogén és az argon inert gázok, ezért frakcionált mennyiségük az egér légzésével nem változik. Zárt rendszerben a környezet végül hipoxikussá válik .
Nyílt légzésmérés
Nyitott rendszer esetén a tervezési korlátok magukban foglalják az állati kamra kimosási jellemzőit és a gázelemző készülékek érzékenységét. Az alapelv azonban ugyanaz marad: Ami bejön, annak ki kell jönnie. A nyitott és a zárt rendszer elsődleges megkülönböztetése az, hogy a nyitott rendszer levegőt áramol át a kamrán (azaz a levegőt szivattyú tolja vagy húzza) olyan sebességgel, amely folyamatosan pótolja az állat által kimerült O 2 -ot, miközben eltávolítja a CO 2 -ot és a vizet. az állat által termelt gőz. A térfogatáramnak elég nagynak kell lennie annak biztosítására, hogy az állat soha ne használja fel a kamrában jelenlévő összes oxigént, ugyanakkor a sebességnek elég alacsonynak kell lennie ahhoz, hogy az állat elegendő O 2 -ot fogyasszon a kimutatáshoz. 20 g-os egér esetében a kb. 200 ml / perc áramlási sebesség 500 ml-es tartályokon keresztül jó egyensúlyt biztosít. Ebben az áramlási sebesség, 40 ml O 2 hozzuk a kamrát és a teljes levegő térfogata a kamrában cserélődik 5 percen belül. Más kisebb állatok esetében a kamra térfogata sokkal kisebb lehet, és az áramlási sebességet is csökkentenék. Felhívjuk figyelmét, hogy melegvérű vagy endoterm állatok ( madarak és emlősök ) esetében a kamra méretét és / vagy áramlási sebességét választanák ki, hogy jobban megfeleljenek az anyagcserének.
Számítások
A VO 2 és / vagy VCO 2 sebességének kiszámításához meg kell ismerni a kamrába való be- és kiáramlási sebességet, valamint az állatkamrába be- és onnan kilépő gázkeverékek frakcionált koncentrációit. Az anyagcsere sebességét általában az egyensúlyi állapotok alapján számítják ki (vagyis az állat anyagcseréjét feltételezzük állandónak). Az elfogyasztott oxigén sebességének ismeretéhez ismerni kell az áramlásmérő helyét az állati kamrához viszonyítva (ha a kamra előtt áll, akkor az áramlásmérő "felfelé", ha a kamra után van elhelyezve, akkor az áramlásmérő "lefelé") "), és hogy vannak-e reaktív gázok (pl. CO 2 , víz , metán , lásd inert gáz ).
Az áramlásmérővel ellátott nyitott rendszer esetén a vizet (pl. Vízmentes kalcium-szulfát ) és a CO 2 -ot (pl. Szén-dioxid- adszorbens, például Ascarite II, az Arthur H. Thomas Co. bejegyzett védjegye) eltávolítják az oxigénelemző készüléket megelőzően , megfelelő egyenlet az
A nyílt rendszer downstream áramlásmérő, a víz és a CO 2 előtt eltávolítjuk az oxigén analizátor, egy megfelelő egyenlet
hol
- FR az STP-re beállított térfogatáram (lásd a hőmérséklet és a nyomás standard feltételeit )
- F az O 2 jelentése a frakcionális jelen lévő oxigén mennyiségének a a jelenlegi levegőáram (a kiindulási vagy referencia), és
- F ex O 2 jelentése a frakcionális jelen lévő oxigén mennyiségének a ex aktuális légáram (amit az állat fogyasztott az alapértékekhez viszonyítva időegység alatt).
Például, értékek BMR 20 g egér ( Mus musculus ) lehet FR = 200 ml / perc, és a leolvasott frakcionált koncentrációja O 2 egy oxigén analizátor van F a O 2 = 0,2095, F ex O 2 = 0,2072 . Az oxigénfogyasztás számított sebessége 0,58 ml / perc vagy 35 ml / óra. Feltételezve, hogy 20,1 joule / milliliter O 2 égési entalpia , akkor kiszámítanánk az egér hőtermelését (és ezáltal az anyagcseréjét) 703,5 J / h-nak.
Respirometriás berendezések
A nyílt áramlású rendszerek esetében a berendezések és alkatrészek listája hosszú a zárt rendszer alkatrészeihez képest, de a nyitott rendszer legfőbb előnye, hogy lehetővé teszi az anyagcsere sebességének folyamatos rögzítését. A hipoxia kockázata nyitott rendszerben is sokkal kisebb.
Szivattyúk a levegő áramlásához
- Vákuumszivattyú : szivattyúra van szükség a levegő behatolásához (azaz az áramlás irányába) vagy a levegő behúzásához (azaz az áramlás irányába történő elhelyezéséhez) az állatkamrába és a légzésmérő átfolyó rendszerbe.
- Alminta szivattyú: A levegőnek az analizátorokon történő áthúzásához egy kicsi, stabil, megbízható szivattyút használnak.
Áramlásmérő és áramlásszabályozók
- Buborék áramlásmérők: Az áramlási sebesség mérésének egyszerű, ugyanakkor rendkívül pontos módja a szappanfólia buborékjainak üvegcsövekbe történő mozgásának időzítése ismert térfogatú jelek között. Az üvegcső alulról (tolórendszerek esetén) vagy felülről (húzórendszerek esetén) csatlakozik a légáramhoz. A cső tövéhez rögzített kis gumipipetta izzó mind a szappanbuborékok tartályaként, mind pedig szállító rendszerként működik. A művelet egyszerű. Először nedvesítse meg az üvegfelületet a buborékok útja mentén (pl. Nyomja meg az izzót, hogy a légáramlás nagy mennyiségű szappant toljon fel az üvegen), hogy gyakorlatilag súrlódásmentes felületet kapjon. Másodszor, szorítsa meg az izzót úgy, hogy egy tiszta buborék keletkezzen. Stopperrel a kezében rögzítse azt az időt, amely szükséges ahhoz, hogy a buborék az üvegen látható jelek között haladjon. Jegyezzük fel a felső jelre rögzített térfogatot (pl. 125 = 125 ml), osszuk el a térfogatot a jelek közötti utazáshoz szükséges idővel, és az eredmény az áramlási sebesség (ml / s). Ezeket a műszereket különféle forrásokból lehet megvásárolni, de megfelelő méretű, üveges volumetrikus pipettákból is elkészíthetők .
- Akril áramlásmérők: Bizonyos körülmények között nagy áramlási sebesség mellett egyszerű akril áramlásmérőket (0–2,5 liter / perc) használhatunk az anyagcsere kamrákon keresztüli áramlási sebességek szabályozására. A mérők az anyagcsere-kamráktól felfelé helyezkednek el. Az áramlásmérők használata egyszerű, de naponta kétszer kalibrálni kell őket a légzésmérő rendszerben történő használatra: egyszer a felvétel megkezdése előtt (de miután az állatot lezárták a kamrában !!), majd újra a felvétel végén (az állat előtt eltávolítják a kamrából). A kalibrálást buborékáramlásmérővel kell elvégezni, mert az akrilmérők kalibrációs jegyei csak hozzávetőlegesek. Az áramlási sebességek megfelelő kalibrálásához ne feledje, hogy az áramlásmérőn átáramló levegő barometrikus nyomását és hőmérsékletét (amelyet feltételezzük, hogy megegyezik a szoba hőmérsékletével) fel kell jegyezni.
- Tömegáramlásmérők : Az oxigénfogyasztás vagy a szén-dioxid-képződés kiszámításához szükséges egyenletek feltételezik, hogy a kamrákba és a kamrákba áramló áramlási sebességek pontosan ismertek. Olyan tömegáramlásmérőket használunk, amelyeknek az az előnye, hogy a hőmérséklettől és a légnyomástól független áramlási sebességet eredményeznek. Ezért ezeket az áramlási sebességeket úgy tekinthetjük, hogy azok a szokásos körülményekhez igazodnak (normál hőmérsékleti nyomás). Csak egy helyen mérjük és szabályozzuk az áramlást - a kamrától lefelé. Ezért azt kell feltételeznünk, hogy a be- és kiáramlás aránya megegyezik. A légzésmérő rendszer építése során azonban az áramlás sebességét minden lépésnél, minden csatlakozáson meg kell mérni az áramlás integritásának ellenőrzése érdekében.
- Tűszelepek : A tömegáramlásmérőket tömegáram-szabályozókkal lehet megvásárolni, amelyek lehetővé teszik az áramlási sebesség beállítását. Ezek azonban drágák. A respirometriai kutatások gyakran megpróbálnak egynél több állatot mérni, amihez állatonként egy kamra és ezáltal az egyes kamrákon keresztül szabályozott áramlás szükséges. Alternatív és költséghatékonyabb módszer az áramlás szabályozására a rozsdamentes vagy szénacél tűszelepeken keresztül történik. A tűszelepek és a tömegáram-mérők költséghatékony eszközt biztosítanak a kívánt áramlási sebesség eléréséhez. A szelepek körülbelül 20 dollárba kerülnek.
Cső és kamrák
- Cső és csatlakozások: Különböző típusú csövek használhatók a légzésmérő rendszer alkatrészeinek összekapcsolására az állati kamrával és onnan. Különféle rugalmas csövek használhatók, a rendszer jellemzőitől függően. Az acetil, a Bev-A-Line, a Kynar, a nylon, a Tygon csövek és csatlakozók a rendszer azon régióiban használhatók, ahol az oxidáló atmoszférák alacsonyak (pl. Csak az ózon háttérszintje); A tefloncsöveket akkor javasoljuk, ha várható az észlelhető ózonmennyiség jelenléte, mivel az inert az ózonhoz. A tefloncsövek drágábbak és nem rendelkeznek rugalmassággal.
- Metabolikus kamrák: A kamrák lehetnek üvegedények, gumidugóval a fedél számára; fecskendős hordók kis állatok és rovarok számára; vagy plexiből építették . Ideális esetben a kamrákat inert anyagokból kell építeni; például az akril műanyag elnyelik O 2 , és lehet egy rossz választás respirometria nagyon kis rovarok. A kamrákat úgy kell megépíteni, hogy a gázok gyorsan keveredjenek a kamrában. Egy kis gerinces számára a legegyszerűbb anyagcsere-kamra egy dugóval ellátott üvegedény lehet. A dugók két csatlakozóval vannak ellátva: a tefloncsövek rövid meghosszabbításai vannak a vezeték csatlakozásához. A teflon csőhosszabbításokat a válaszfalon keresztül tolják át, és a vezetékcsatlakozás befejeződik egy kis tömlőkapocs rögzítésével a teflon csőhosszabbítás alapjához. Ezenkívül biztosítani kell az edény belsejében a bemeneti nyílás kiterjesztését - ez biztosítja, hogy az áramló áramlás ne mossa el az állat kilégzési gázait. Az állatot belül lezárják, és a gumidugót tépőzáras hevederekkel tartják a helyén . Ha egy upstream rendszert használunk, az anyagcsere-kamra szivárgása az állati levegő elvesztését eredményezi, és ezért alulbecsüli az állat anyagcseréjét. Amikor bezár egy állatot egy anyagcsere-kamrában, figyelmet kell fordítani a pecsétre. A fedél bezárása előtt a tömítések biztosítása érdekében határozottan dugja be a dugót az üvegbe, és ellenőrizze, hogy egyenletes-e. Használjon 1-2 hevedert (2 jobb), és húzza meg szorosan. Akril (plexi) kamrák kerülnek kialakításra egyes felhasználásokhoz, de pontos tervezésre lesz szükség a megfelelő ülések biztosításához; a tömítések segítenek, és a szorosan illeszkedő bilincsek megfontolt használata minimalizálja a szivárgást.
- Súrolócsövek: A vizet az állati kamra előtt és után el kell távolítani. Az egyik elrendezés egy nagy Drierite akriloszlopot (8 mesh (skála) , azaz viszonylag durva) használna felfelé (a nyomószivattyú előtt, az állati kamra előtt), és több csövet kisebb hálóval (10–20, azaz , viszonylag finom) Drierite a víz eltávolítására az állati kamra után. A mosócső előkészítéséhez győződjön meg arról, hogy a cső mindkét végén kis mennyiségű pamut van, hogy megakadályozza a porszemcsék eljutását az analizátorokba. Használjon kis mennyiségű pamutot, mondjuk 0,005 g körül, csak annyit, hogy a por ne kerüljön a csőbe. Nagy mennyiségű pamut gátolja a levegő áramlását, ha / ha nedves lesz. Öntsön tölcsérrel a Drierite-t a csőbe, érintse meg a csövet a padon, hogy szorosan bepakolja a szemeket (a felület növelése érdekében - a laza Drierite-n keresztül a levegő + víz szivárog át, gyakran cserélve a mosógépet), és fedje le kis mennyiségű pamut. A szén-dioxid eltávolításához] az állókamra előtt és után az Ascarite II-t használják (az Ascarite II az Arthur H. Thomas Co. bejegyzett védjegye). Az Ascarite II NaOH-ot tartalmaz, amely maró hatású (ezért ne kerüljön a bőrére, és tartsa távol a vizet). A súrolócsövet úgy állítják elő, hogy kis mennyiségű pamutot helyeznek a cső végébe, és az út egyharmadát 10–20 mesh lyukú Drierite-tel töltik meg, kis mennyiségű pamutot, majd a cső további harmadát az Ascarite II-vel adják. egy újabb pamutréteg, utána újabb Drierite és a cső lezárása újabb kis mennyiségű pamutval. Érintse meg a csövet a padon, amikor minden réteg hozzáadódik a szemek csomagolásához. Megjegyzés: A Driereite felhasználható újra és újra (kemencében történő melegítés után), bár jelezve, hogy a Drierite ismételt szárítással elveszíti színét; Az Ascarite II-t egyszer használják, és veszélyes hulladéknak minősül .
Elemzők
- Szén-dioxid- analizátor: A CO 2 -elemzők jellemzően infravörös alapú detektálási módszereket használnak annak érdekében, hogy kihasználják azt a tényt, hogy a CO 2 elnyeli az infravörös fényt, és kissé hosszabb hullámhosszon újból bocsát ki fényt. Az analizátor panelmérője a teljes 0,01-10% CO 2 tartományban jelenik meg, és az adatrögzítéshez a CO 2 koncentrációval arányos kimeneti feszültséget is létrehoznak.
- Oxigénelemző : A légzésméréshez alkalmas oxigénelemző készülékek számos oxigénérzékelőt használnak , ideértve a galván ("környezeti hőmérséklet"), paramágneses , polarográfiai ( Clark típusú elektródok) és a cirkónium ("magas hőmérséklet") érzékelőket. A galvanikus O 2 analizátorok savas elektrolitot , nehézfém anódot és vékony gázáteresztő membránt tartalmazó üzemanyagcellát használnak . Mivel a parciális nyomása az O 2 közelében az anód nulla, O 2 hajtja diffúzió a anód membránon keresztül olyan sebességgel arányos környezeti O 2 parciális nyomását. A tüzelőanyag-cella olyan feszültséget lineárisan arányos a O 2 parciális nyomását a membrán. Amíg a kabinet hőmérséklete stabil, és feltéve, hogy a levegő áramlása az üzemanyagcellán keresztül stabil és a tartományon belül van, a válasz 0,01% vagy jobb lesz, a támogató elektronika, szoftver és egyéb szempontok függvényében.
Végül egy számítógépes adatgyűjtő és -vezérlő rendszer tipikus kiegészítője lenne a rendszer kiegészítésének. Ahelyett, hogy a regisztráló készüléken , folyamatos nyilvántartást oxigénfogyasztás vagy szén-dioxidot termelés készülnek a támogatás egy analóg-digitális átalakító kapcsolt számítógépre. A szoftver rögzíti, szűri, konvertálja és megjeleníti a jelet a kísérletező igényeinek megfelelően. Számos vállalat és egyén szolgálja a légzésmérő közösséget (pl. Sable Systems , Qubit Systems, lásd még Warthog Systems).
Mitokondriális anyagcsere arányok
A test belsejében az oxigén a sejtekbe jut, a sejtekben pedig a mitokondriumokba , ahol a szervezet által igényelt energia nagy részének termelésével elfogyasztják. A mitokondriális respirometria a mitokondriumok oxigénfogyasztását méri egész élő állat bevonása nélkül, és ez a fő eszköz a mitokondriumok működésének tanulmányozásában. Három különböző típusú mintának vethető alá ilyen respirometriai vizsgálat: izolált mitokondrium (sejttenyészetekből, állatokból vagy növényekből); permeabilizált sejtek (sejttenyészetekből); és permeabilizált rostok vagy szövetek (állatokból). Az utóbbi két esetben a sejtmembránt áteresztővé teszik olyan vegyszerek hozzáadásával, amelyek szelektíven a mitokondriális membránt sértetlenül hagyják. Ezért azok a vegyi anyagok, amelyek általában nem képesek átjutni a sejtmembránon, közvetlenül befolyásolhatják a mitokondriumokat. A sejtmembrán permeabilizációja révén a sejt élő, meghatározott organizmusként megáll, és csak a mitokondriumokat hagyja működőképes struktúrákként. A teljes állati respirometriával ellentétben a mitokondriális respirometria oldatban történik, azaz a mintát táptalajban szuszpendáljuk. Ma a mitokondriális respirometriát főleg zárt kamrás megközelítéssel végzik.
Zárt kamrás rendszer
A megfelelő közegben szuszpendált mintát hermetikusan zárt anyagcserekamrába helyezzük. A mitokondriumokat meghatározott „állapotokba” hozzák szubsztrátok vagy inhibitorok egymás utáni hozzáadásával. Mivel a mitokondrium oxigént fogyaszt, az oxigénkoncentráció csökken. Az oxigénkoncentráció ezen változását egy oxigénérzékelő rögzíti a kamrában. Az oxigén csökkenésének sebességéből (figyelembe véve az oxigén diffúziójának korrekcióját) kiszámítható a mitokondrium légzési sebessége.
Alkalmazások
Alapkutatás
A mitokondriumok működését a bioenergetika területén vizsgálják . A különböző fajok mitokondriumai közötti funkcionális különbségeket respirometriával vizsgálják, mint az összehasonlító fiziológia szempontját .
Alkalmazott kutatás
A mitokondriális respirometriát a mitokondriális funkcionalitás vizsgálatára használják mitokondriális betegségek vagy olyan betegségek esetében, amelyek (feltételezett) szoros kapcsolatban állnak a mitokondriumokkal, pl. 2-es típusú diabetes mellitus , elhízás és rák . További alkalmazási területek például a sporttudomány, valamint a mitokondriális funkció és az öregedés közötti kapcsolat .
Felszerelés
A szokásos felszerelés magában foglal egy lezárható anyagcsere-kamrát, egy oxigénérzékelőt, valamint az adatok rögzítésére, keverésre, termosztatizálásra szolgáló eszközöket és a vegyi anyagok kamrába juttatásának módját. Amint azt az egész állati respirometriánál fent leírtuk, az anyagok megválasztása nagyon fontos. A műanyagok oxigéntároló képességük miatt nem alkalmasak a kamrára. Ha a műanyagok elkerülhetetlenek (pl. O-gyűrűk, keverők bevonata vagy dugók), nagyon alacsony oxigénáteresztő képességű polimereket lehet használni (például PVDF , pl. PTFE-vel szemben ). A kamra anyagaiba vagy azokból fennmaradó oxigéndiffúzió úgy kezelhető, hogy a mért oxigénáramokat korrigáljuk a műszeres oxigén háttérfluxussal. Az említett komponenseket tartalmazó teljes hangszert gyakran oxigrafnak nevezik. A fent említett, egész állatból készült rspirometriához berendezéseket biztosító vállalatok általában nem vesznek részt a mitokondriális légzésben. A közösséget az olyan vállalatok, mint az Oroboros Instruments, a Hansatech, a Respirometer Systems & Applications, az YSI Life Sciences vagy a Strathkelvin Instruments, széles körű ár- és kifinomult szintű szolgáltatásokkal látják el.