A fehérjék gél elektroforézise - Gel electrophoresis of proteins

Fehérjék SDS-PAGE , Coomassie Brilliant Blue festéssel

A fehérjeelektroforézis egy módszer a folyadékban vagy kivonatban lévő fehérjék elemzésére. Az elektroforézist kis mennyiségű mintával lehet elvégezni számos alternatív módon, hordozóközeggel vagy anélkül: SDS poliakrilamid gélelektroforézis (röviden: gélelektroforézis, PAGE vagy SDS-elektroforézis), szabad áramlású elektroforézis , elektrofókusz , izotakoforézis , affinitás elektroforézis , immunoelektroforézis , ellenelektroforézis és kapilláris elektroforézis . Mindegyik módszernek számos változata van, előnyökkel és korlátokkal. A gél -elektroforézist gyakran elektroblotti immunblotolással kombinálva végzik , hogy további információkat kapjanak egy adott fehérjéről. A gyakorlati korlátok miatt a fehérje -elektroforézis általában nem alkalmas preparatív módszerként.

Denaturáló gél módszerek

SDS-PAGE

Az SDS-PAGE, nátrium-dodecil-szulfát- poliakrilamid-gélelektroforézis, leírja a kapcsolódó technikák gyűjteményét a fehérjék elektroforetikus mobilitása (a polipeptidlánc molekulatömegének függvénye) szerinti elválasztására denaturált (széthajtott) állapotban. A legtöbb fehérjében az SDS kötődése a polipeptidlánchoz egyenletes töltéseloszlást biztosít a tömeg egységre, ezáltal az elektroforézis során hozzávetőleges méretű frakcionálást eredményez.

Az SDS erős mosószer, amelyet natív fehérjék kibontatlan, egyedi polipeptidekre denaturálására használnak . Amikor egy fehérje keveréket 100 ° C -ra melegítünk SDS jelenlétében, a mosószer a polipeptid gerincét körbeveszi. Ebben a folyamatban a polipeptidek belső töltései elhanyagolhatóvá válnak az SDS által okozott negatív töltésekhez képest. Így a polipeptidek a kezelés után rúdszerű szerkezetekké válnak, amelyek egyenletes töltéssűrűséggel rendelkeznek, azaz azonos nettó negatív töltés egységnyi hosszonként. Ezen fehérjék elektroforetikus mobilitása a molekulatömegük logaritmusainak lineáris függvénye lesz .

Natív gél módszerek

A natív gélek, más néven nem denaturáló gélek, a még összehajtott állapotban lévő fehérjéket elemzik. Így az elektroforetikus mobilitás nemcsak a töltés-tömeg aránytól függ, hanem a fehérje fizikai alakjától és méretétől is.

Kék natív PAGE

A BN-PAGE natív PAGE technika, ahol a Coomassie Brilliant Blue festék biztosítja az elektroforetikus elválasztáshoz szükséges töltéseket a fehérjekomplexekhez. A Coomassie hátránya, hogy a fehérjékhez kötődve mosószerként viselkedhet, ami a komplexek disszociációjához vezet . Egy másik hátrány a kemolumineszcencia potenciális kioltása (pl. A későbbi Western blot detektálás vagy aktivitásvizsgálatok során) vagy a proteinek fluoreszcenciája protetikus csoportokkal (pl. Hem vagy klorofill ) vagy fluoreszkáló festékekkel megjelölve.

Natív PAGE törlése

CN-PAGE (közkeletű nevén natív PAGE) elválasztja a savas vízoldható és a membrán fehérjék egy poliakrilamid grádiens gél. Nem használ feltöltött festéket, így a fehérjék elektroforetikus mobilitása a CN-PAGE-ban (ellentétben a BN-PAGE töltéseltolási technikával) összefügg a fehérjék belső töltésével. A migrációs távolság a fehérje töltésétől, méretétől és a gél pórusméretétől függ. Ez a módszer sok esetben alacsonyabb felbontású, mint a BN-PAGE, de a CN-PAGE előnyöket kínál, amikor a Coomassie festék zavarja a további analitikai technikákat, például nagyon hatékony mikroméretű elválasztási technikának írták le a FRET elemzésekhez. A CN-PAGE is enyhébb, mint a BN-PAGE, így képes megtartani a BN-PAGE körülményei között disszociált membránfehérje- komplexek labilis szupramolekuláris egységeit .

Mennyiségi natív PAGE

Az érdekes hajtogatott fehérjekomplexek tisztán és kiszámíthatóan különülnek el a poliakrilamid gél sajátos tulajdonságai miatt. Az elkülönített fehérjéket folyamatosan fiziológiás eluensbe eluáljuk, és frakciógyűjtőbe szállítjuk. A fém kofaktorok négy-öt PAGE frakcióban azonosíthatók és abszolút számszerűsíthetők a nagy felbontású ICP-MS segítségével . Az izolált metalloproteinek megfelelő szerkezetét oldat -NMR -spektroszkópiával határozhatjuk meg .

Pufferrendszerek

A fehérjék feltételezett migrációja Laemmli gélrendszerben

A legtöbb fehérjeleválasztást "diszkontinuális" (vagy DISC) pufferrendszer alkalmazásával hajtják végre, amely jelentősen növeli a gélen belüli sávok élességét. A nem folytonos gélrendszerben végzett elektroforézis során az elektroforézis korai szakaszában iongradiens keletkezik, amely az összes fehérjét egyetlen éles sávba fókuszálja. Az iongradiens kialakulását úgy érjük el, hogy olyan pH-értéket választunk, amelynél a puffer ionjai csak mérsékelten töltődnek fel az SDS-bevonatú fehérjékhez képest. Ezek a körülmények olyan környezetet biztosítanak, amelyben Kohlrausch reakciói meghatározzák a moláris vezetőképességet . Ennek eredményeképpen az SDS-bevonatú fehérjék néhány percen belül többszörösére koncentrálódnak egy vékony, 19 μm nagyságú zónában. Ebben a szakaszban minden fehérje azonos vándorlási sebességgel vándorol izotakoforézissel . Ez a gél olyan régiójában fordul elő, amelynek pórusai nagyobbak, így a gélmátrix nem késlelteti a vándorlást a fókuszálás vagy "egymásra rakás" során. A fehérjék méret szerinti elkülönítését a gél alsó, "feloldó" régiójában érjük el. A feloldó gél tipikusan sokkal kisebb pórusméretű, ami szitáló hatáshoz vezet, amely most meghatározza a fehérjék elektroforetikus mobilitását. Ugyanakkor a gél elválasztó részének olyan pH-értéke is van, amelyben a pufferionok átlagosan nagyobb töltést hordoznak, ami azt eredményezi, hogy "felülmúlják" az SDS-el borított fehérjéket, és megszüntetik az iongradienst, és ezáltal a halmozási hatást.

Egy nagyon elterjedt, megszakítás nélküli pufferrendszer a trisz-glicin vagy " Laemmli " rendszer, amely 6,8 pH-ra halmozódik és ~ 8,3-9,0 pH-n oldódik fel. Ennek a rendszernek az a hátránya, hogy ezek a pH-értékek elősegíthetik a diszulfidkötések kialakulását a fehérjék cisztein- maradékai között, mivel a cisztein pKa értéke 8-9, és mivel a töltőpufferben lévő redukálószer nem migrál együtt a fehérjékkel. A pufferelési technológia legújabb fejlesztései enyhítik ezt a problémát azáltal, hogy a fehérjéket jóval a cisztein pKa alatti pH-ján oldják fel (pl. Bisz-trisz , pH 6,5), és olyan redukálószereket (pl. Nátrium-biszulfit) tartalmaznak, amelyek a fehérjék előtt a gélbe kerülnek. redukáló környezet fenntartása. Az alacsonyabb pH -értékű pufferek használatának további előnye, hogy az akrilamid gél stabilabb alacsonyabb pH -értékeknél, így a gélek hosszú ideig tárolhatók használat előtt.

A fehérjék SDS gradiens gélelektroforézise

Feszültség hatására az anionok (és a negatív töltésű mintamolekulák) az alsó kamrában lévő pozitív elektróda (anód) felé vándorolnak, a vezető ion Cl ^- (nagy mobilitás és nagy koncentráció); a glicinát a záróion (alacsony mobilitás és alacsony koncentráció). SDS-fehérje részecskék nem vándorolnak szabadon közötti határon a Cl ^- a gél-pufferban, és a Gly ^- a katód puffer. Friedrich Kohlrausch megállapította, hogy az Ohm -törvény az oldott elektrolitokra is vonatkozik . Mivel a feszültségesés közötti Cl ^- és a Glycine-pufferek, proteinek tömörített (halmozott) be mikrométer vékony rétegben. A határ áthalad a pórusgradiensen, és a gélmátrix súrlódási ellenállása miatt a fehérjehalom fokozatosan szétoszlik. Az egymásra rakás és a leválasztás folyamatosan történik a gradiens gélben, minden fehérje esetében más helyzetben. A teljes fehérjebontáshoz a poliakrilamid-gél koncentrációjának meg kell haladnia a 16% T-t. A "Laemmli" kétgél rendszere egyszerű gradiens gél. A pufferek pH-folytonosságának nincs jelentősége az elválasztási minőség szempontjából, és nincs szükség más pH-értékű "halmozó gélre".

Megjelenítés

A legnépszerűbb fehérjefolt a Coomassie Brilliant Blue . Ez egy anionos festék, amely nem specifikusan kötődik a fehérjékhez. A gélben lévő fehérjéket ecetsav rögzíti és egyidejűleg festik. A gélbe beépített felesleges festéket eltávolíthatjuk úgy, hogy ugyanazzal az oldattal eltávolítjuk a festéket. A fehérjéket kék alapon észlelik, tiszta alapon.

Ha a Coomassie -féle festésnél érzékenyebb módszerre van szükség, általában ezüstfestést alkalmaznak. Az ezüst festés érzékeny eljárás a fehérjék nyomokban történő kimutatására a gélekben, de megjelenítheti a nukleinsavat vagy a poliszacharidokat is.

A piacon rendelkezésre állnak olyan vizualizációs módszerek, amelyek nem használnak festéket, például Coomassie -t vagy ezüstöt. Például a Bio-Rad Laboratories „foltmentes” géleket forgalmaz az SDS-PAGE gélelektroforézishez. Alternatív megoldásként az Azure Biosystems , például AzureRed vagy Azure TotalStain Q reverzibilis fluoreszkáló festékei is használhatók.

A nukleinsav -gélelektroforézishez hasonlóan gyakran használnak nyomkövető festéket . Az ismert elektroforetikus mobilitású anionos festékeket általában a mintapuffer tartalmazza. Nagyon gyakori nyomkövető festék a brómfenol -kék . Ez a festék lúgos és semleges pH -értékű, és egy kis negatív töltésű molekula, amely az anód felé mozog. Mivel rendkívül mobil molekula, a legtöbb fehérje előtt halad.

Orvosi alkalmazások

A fehérje elektroforézis gél sematikus ábrázolása.

Szérumfehérje elektroforézis, amely paraproteint mutat (csúcs a gamma zónában) myeloma multiplexben szenvedő betegben .

A gyógyászatban , protein elektroforézis egy módszer elemzésének fehérjék elsősorban vérszérumban . A gélelektroforézis széles körű alkalmazása előtt a fehérje elektroforézist szabad áramlású elektroforézissel (papíron) vagy immunoelektroforézissel végezték.

Hagyományosan a vérfehérjék két osztályát veszik figyelembe: szérumalbumin és globulin . Általában arányosak, de az albumin, mint molekula sokkal kisebb és enyhén, negatív töltésű, ami az albumin felhalmozódásához vezet az elektroforetikus gélen. Az albumin előtti kis sáv a transztiretint jelenti (más néven prealbumin). A gyógyszerek vagy test vegyi anyagok bizonyos formái saját sávot okozhatnak, de általában kicsi. Rendellenes sávok (tüskék) láthatók a meghatározatlan jelentőségű monoklonális gammopathiában és a myeloma multiplexben , és hasznosak ezen állapotok diagnosztizálásában.

A globulinokat sávos mintájuk alapján osztályozzák (fő képviselőikkel):

Az alfa (α) sáv két részből áll, 1 és 2:
- α ₁ - α ₁ -antitripszin , α ₁ -savas glikoprotein.
- α ₂ - haptoglobin , α ₂ makroglobulin , alfa ₂ antiplazmin , cöruloplazmin .
A béta (β) sáv - transzferrin , LDL , komplement
A gamma (γ) sáv - immunglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG és IgM). A paraproteinek (myeloma multiplexben) általában ebben a sávban jelennek meg.

A szokásos jelenlegi orvosi eljárás számos fehérje meghatározását foglalja magában a plazmában, beleértve a hormonokat és enzimeket, amelyek közül néhányat elektroforézissel is meghatároznak. A gélelektroforézis azonban főként kutatási eszköz, még akkor is, ha a tárgy vérproteinek.

Languages

In other projects